A transzglutamináz coeliakia epitópja

A coeliakiás anti-TG2 antitestek konformáció-dependens kötődést mutatnak. Molekuláris modellezéssel és irányított mutagenesis segítségével egy összetett TG2 epitópot azonosítottunk, mely konformációs és 3 domén részvételével alakul ki. Az epitóp központja a 153-154-es glutaminsavak körüli felszín, melyhez közel van a 19-es arginin és a 659-es metionin is. Eredményeink alapján e két utóbbinak is szerepe van a kötődésben, bár a 153-as és a 19-es aminosav együttes részvétele látszik a legfontosabbnak és önmagában elegendő. Emiatt az antitestek a molekula kinyílása és az enzimreakció során is kötve maradhatnak. A bázikus argininek gyakran részei felszíni epitópoknak, és kombinációjuk ellentétes töltésű savanyú aminosavakkal, mint például a 153-as vagy 154-es glutaminsavval, energetikai szempontból kedvező kötőhelyet képezhet. Kimutatták, hogy a kötődés erőssége úgy is modellezhető, hogy az antitest megkötődése révén a molekula mekkora felszíne válik rejtetté, azaz a kötés mekkora változást okoz az oldattal érintkező felszínben (Rajamani és mtsai 2004). Az 19-153-154-es aminosavak részvétele esetén ez

jelentős, amit a 659-es lefedése még tovább fokoz. Az N-terminális rész vagy a C-terminális rész alternatív módon is elegendő a coeliakia antitestek kötődéséhez, míg a core domén területén levő aminosavak szerepe obligát. A coeliakia antitestek egy részénél és a MAb885 esetén a 19-es aminosav egyedüli cseréje nem okozott változást a kötődésben, de kompeticiós vizsgálatokban ezek is versengtek a másik csoporttal, ahol a 19-es aminosav cseréje esetén a kötődése csökkent. A betegekből készített monoklonális antitestek esetén jól követhető volt, hogy ugyanazon betegben megtalálhatók azok az antitestek is, melyek reagálnak és azok is, amelyek nem reagálnak az R19S mutánssal, de minden monoklonális antitest kötődése megszűnt az R19S-E153S kettős mutáció esetén. A két csoport közötti versengést mind a monoklonális antitestekkel, mint természetes betegsavókkal és az azokból tisztított IgA és IgG frakciókkal is igazolni lehetett. Ezek a vizsgálatok azt is bizonyítják, hogy a coeliakiában termelődő IgG antitestek azonos epitópot ismernek fel, mint az IgA antitestek, így alátámasztják azt, hogy az IgG antitestek diagnosztikus jelentősége hasonló.

Egy korábbi vizsgálat során aTG2 katalítikus triádjának megváltoztatása (Byrne és mtsai 2004) is csökkentette a coeliakiás antitestek kötődését. Ez a terület nem része a miáltalunk azonosított epitópnak, sőt a molekula épp ellentétes felszínén található. A Byrne vizsgálatban a mutagenesis során a kiválasztott aminosavakat alaninra cserélték, mely azoban hidrofób felszínt és stabilitási problémákat eredményezhet, különösen azt is figyelembe véve, hogy a 277-es cisztein a molekula vázát merevítő egyik legnagyobb hélixének végén található. Ezért lehetséges, hogy az aktív hely módosítása a konformációs epitóp torzulását okozta. Saját vizsgálataink során (Király és mtsai 2009) a 277-es cisztein szerinre történő cseréje nem csökkentette a coeliakiára vonatkozó antigenitást. Azt is kimutattuk, hogy a coeliakiás antitestek a működő enzim felszínén megkötődve maradnak.

Ez nehezen képzelhető el, ha épp a katalítikus centrum volna a kötőhely, mivel az antitestek jelenlétében folyamatosan termelődnek a keresztkötött termékek, míg az antitestet magát az enzim nem használja szubsztrátként (Király és mtsai 2006). A coeliakia antitestek egy aktív helyre kötődő gliadin-analóg inihibitor jelenlétében is jól kötődtek (Myrsky és mtsai 2009b), ez gyakorlatilag kizárja azt, hogy maga az aktív hely lenne a fő epitóp. Eredményeink viszont összhangban vannak a többi korábbi epitóptérképezési vizsgálat eredményeivel, annak ellenére, hogy azokban a következtetések gyakran mások voltak. Úgy tűnt, hogy független epitópokról van szó a molekula több szerkezeti egységén. Sblattero és munkatársai viszont kimutatták, hogy az N-terminális domént és a core domén első részét tartalmazó fragment a legfontosabb a kötődésben (Sblattero és mtsai 2002). Ez megfelel annak, hogy az összetett epitóp centruma a 153-154-es aminosavak körül van. Az előző vizsgálatok igazolták azt is, hogy az N-terminális és C-terminális rész is részt vesz a coeliakia antitestek kötésében. Ezek olyan közel vannak egymáshoz a csukott formában, hogy

önmagukban is közös epitópot alkothatnának, bár az I-III-IV domén mutánssal kapott eredményeink azt jelzik, hogy a core domén részvétele nélkül effektív kötőhely nem jön létre (Simon-Vecsei és mtsai 2012). A coeliakia antitestek kötődését gátló MAb885 kötőhelye is a core doménen van, az N-teminális és C-terminális mutációi nem befolyásolják (50. ábra), így az utóbbiakhoz történő kötődés semmiképp sem független a molekula középső részének részvételétől. Érdekes kérdés azonban az, hogy hogyan kötődhettek a coeliakia antitestek a Seissler vizsgálatban olyan fragmentekre is, mint a 227-687-es darab, mely az epitópnak sem N-terminális (19), sem a core doménen lévő fő aminosavait (153-154) nem tartalmazza (Seissler és mtsai 2001). Valószínű, hogy a vizsgálatban alkalmazott folyadékfáziszú kötődés (immunprecipitáció) közben ez a fragmentum is kedvező alakot vehetett fel, habár a reakció csak a savók 69%-ánál marad meg és a kötődési jel is jelentős csökkenést mutatott. A 659-es aminosav körüli felszín ebben a mutánsban jelen volt és annak core doménnel határos részét a 400 körüli aminosavak stabilizálhatták, így az epitóp mintegy fele lényegében rendelkezésre állt. Saját vizsgálatainkban eddig nem készítettünk 431-es mutációt (ezen a helyen egy valin helyezkedik el, mely neutrális töltésű), bár a modellezés szerint a 431-es valin az S4 és S5 kálciumkötőhely közötti felszínen van és oldallánca hasonlíthat a PQPQLPY motívumot tartalmazó gliadin peptidekben lévő leucin oldalláncára.

Az epitóp szerkezetével kapcsolatban felmerülő másik lényeges kérdés az volt, hogy a konformációs epitópok mellett vannak-e lineáris kötőhelyek is. Az urea és guanidin jelenlétében végzett kötődési vizsgálatok azt mutatták, hogy jelentős lineáris kötőhely nincs, a kötődés konformációs epitópot kíván. Ezért további kísérletekre volt szükség annak elbírálására, hogy az általunk készített mutációk hatása ténylegesen azokon az aminosavakon keresztüli kötést rontotta el, amelyeket megváltoztattunk, vagy indirekt módon egy másik, távoli kötőhely felszínét deformálta. Erre jó példa volt kísérleteink kezdetén a 158-as glutaminsav pontmutációja, mely nem is a felszínen, hanem a core domén első alfa-hélixének belsejében, annak bázisa körül helyezkedik el (30. ábra). A kristályszerkezeteken végzett mérések szerint ez a mutáció úgy vezetett a kötődés csökkenéséhez, hogy a hélix dőlési szögét billenthette el. Ez a hatás megváltoztatja a hélix tetején lévő 153-as és 154-es aminosavak relatív helyzetét az N-terminális domén első hélixén lévő 19-es argininhez képest, és nagy valószínűséggel így teszi tönkre a konformációs epitópot akkor is, ha magukat a felszíni aminosavakat nem is cseréltük ki.

Ezért olyan mutációk készítésére törekedtünk, melyek hatása az ismert kristályszerkezetek alapján jobban megítélhető és a felszíni aminosavak cseréje nem vezet a hidrogénkötések megváltozásához sem. A 154-glutaminsavnak megfelelő 199-es helyen a XIII-as véralvadási faktorban egy bázikus lizin van, de egyébként a core domén felszíne a két fehérje kristályszerkezelében nagyon hasonló és ez egy szabad mobilis oldallánc, jelentős

hidrogénkötések nélkül. A XIII-as faktor egy szerkezetileg homológ transzglutamináz, de a coeliakiás antitestek számára nem jó antigén. Ha a TG2 fehérjében a 154-es aminosavat glutaminra cseréltük, sem a katalítikus aktivitás, sem a coeliakiás antitestek kötődése nem csökkent, azaz ennek a szabad oldalláncnak a mutációja nem okozott konformációváltozást.

Ezért a kísérleteinkben a 154-es aminosavat lizínre is kicseréltük. Ez az E154K mutáns viszont hasonló antigén volt, mint az E153S mutáns. Az R19S-E154K-M659S hármas mutáció ugyanúgy megszüntette a coeliakia antitestek kötődését, mint a R19S-E153S-M659S hármas mutáció. Kimutattuk továbbá, hogy a MAb885 antitest kötődését is befolyásolta az E154K mutáció (50. ábra), bár kisebb mértékben, mint a betegből származó monoklonális egyláncú antitestek kötődését (38. ábra). Ezek az eredmények együttesen azt támasztják alá, hogy az általunk létrehozott mutációk a coeliakia antitestek kötődését nem indirekt módon a fehérje konformációjának elrontása révén, hanem valóban a horgonyzópontok cseréjével változtatják meg. A főbb mutánsoknál vizsgáltuk a CD spektrumot is, melyben számottevő eltérés nem volt. A TG2 enzimműködései is az intakt térszerkezethez kötöttek. A R19S mutáns transzamidáló aktivitása megtartott volt. A 153-as helyet érintő mutánsok is rendelkeztek keresztkötő aktivitással, bár ez annak megfelelően alacsonyabb volt, hogy ez az aminosav egyben a katalítikus aktivitáshoz szükséges kálcium megkötésére szolgáló egyik kötőhely része és a mutáció a kálcium megkötésének zavarával is jár (Király és mtsai 2009).

Ezek a mutások viszont GTP-áz aktivitást mutattak (Simon-Vecsei és mtsai 2012).

Egy másik vizsgálatban (Teesalu és mtsai 2011) azt észlelték, hogy heparin hozzáadása csökkenti a coeliakiás antitestek kötődését. A közelmúltban a TG2 heparánszulfát kötőhelyét a 202-222 aminosavak körüli felszínre lokalizálták (Wang Z és mtsai 2012b). Saját vizsgálatunkban a gyorsteszt kifejlesztése során azt észleltük, hogy a heparin valóban nem annyira jól köti a TG2-antitest komplexeket, mint a gelatin, az eredmények azonban nagyon heterogének voltak. A kész, kereskedelmi gyorstesztnél a vért heparinos kapillárisba veszik, és ez nem okoz csökkent jelet. Lehetséges, hogy ez a mennyiség még nem interferál a kötődéssel, vagy valószínűbb az, hogy a TG2 a hemolízis során aggregálódhat és így elegendő kötőhelye van arra, hogy a coeliakia antitesteket és a heparint is megkösse. Saját vizsgálatainkban a S1 kálciumkötőhely mutánsa, mely a 228-233 között aminosavak komplex mutációját tartalmazta, ugyanolyan jól kötötte a coeliakiás antitesteket, mint a vad TG2 fehérje. Meg kell azt is jegyezni, hogy a Wang vizsgálatban nem tisztított rekombináns fehérjékkel vizsgálták a heparánszulfátok kötődését, hanem sejtlízátumokkal különböző TG2 konstrukciók kifejezése után, így a kötődésben már sejtkomponensek is interferenciát okozhattak.

Betegsavóból származó és betegekből készített monoklonális antitestekkel végzett kompeticiós kísérletekkel kimutattuk, hogy a különböző betegek antitestjei ugyanahhoz a fő coeliakiás epitóphoz kötődnek, és hogy ennek dominanciája évtizedeken át tartó aktív

betegség során is megmarad. Hosszan követett betegeinknél is hasonló maradt az antitestek epitópspecifitása. Ez azt jelenti, hogy az anti-TG2 antitestek képződése szabályos, adott felszín ellen irányul és nem véletlenszerűen a TG2 ellen. Az autoimmun betegségekben általában gyakori az intramolekuláris epitope sreading, azaz fokozatosan az autoantigén egyre több epitópja ellen immunválasz keletkezik (Schlosser és mtsai 2005), és hasonló a coeliakiában minor autoantigén, a calreticulin esetében is kimutatható (Sanchez és mtsai 2003). Ezzel szemben a coeliakia antitesteknél alig van szomatikus hipermutáció, ami az antitest epitóp-érésére (affinity maturation) utalna (Di Niro és mtsai 2012). A felnőtt betegeknél ugyan kisebb volt a kötődés csökkenése a fő mutánsoknál, mely lehet másodlagos epitópspecificitások következménye, de ezek mértéke csekély volt és a fő epitóp dominanciája végig megmaradt. Kísérleteinkkel továbbá igazolni tudtuk, hogy a korai látens fázisban lévő betegek antitestjeinek epitópja is ugyanaz, viszont más autoimmun betegségekben termelődő anti-TG2 antitesteknél ez a jellegzetes epitópkötődési mintázat nincs meg. Ezeknek az eredményeknek diagnosztikus jelentősége van. Vad TG2 fehérjével és a releváns mutánsokkal végzett ELISA alapján ugyanis elkülöníthetők a valódi coeliával kapcsolatos antitestreakciók az egyéb, nem specifikus antitestektől. Főként felnőtteknél és májbetegségek esetén gyakoriak a nem coeliakia eredetű anti-TG2 antitestek, melyek diagnosztikus nehézséget okozhatnak. Ezeknél a betegeknél nincs társuló boholyatrophia és általában az EMA vizsgálati eredmény sem pozitív. Az epitópspecifitás kimutatásának az a konzekveniája, hogy a jellegzetes mintázat esetén más autoimmun betegségek jelenléte ellenére is további kivizsgálás, szövettani vizsgálat indokolt.