A coeliakia autoantitestek hatása az angiogenesisre

Myrsky E, Kaukinen K, Syrjänen M, Korponay-Szabó IR, Mäki M, Lindfors K. Coeliac disease-specific

autoantibodies targeted against transglutaminase 2 disturb angiogenesis. Clin Exp Immunol. 2008;152:111-119.

A coeliakia antitestek a szövetekben a kiserek mentén kötődnek és a TG2 szerepet játszik az angiogenesisben (Haroon és mtsai 1999), így az endotél sejtekre gyakorolt biológiai hatás vizsgálata is relevánsnak látszik a coeliakia megértéséhez. Kezdeti tájékozódó vizsgálatunk során kimutattuk, hogy a súlyosan atrófiás coeliakiás vékonybél nyálkahártya érhálózata rendellenes: a kapillárisok száma megkevesbedett és lefutásuk eltér a szokásostól. Azt is kimutattuk, hogy az endothel sejtekhez képest kevesebb a simaizom sejtek aránya ezekben a kiserekben (Myrsky és mtsai 2009a). Ezért in vitro is vizsgáltuk normál endotél sejtek (human umbilical cord vein endothelial cells, HUVEC) differenciálódását (Myrsky 2009b). A sejteket kereskedelmi forrásból (Lonza) szereztük be vagy Palatka és munkatársai szerint (Palatka és mtsai 2006) normál újszülött köldözsinórból preparáltuk. A HUVEC sejtek I-es

típusú kollagénnel bevont tenyésztő edényekben megnyúlnak és 24-72 óra alatt elágazódó érszerű képződményeket kezdenek építeni. Kollagén I. gélben vagy komplex kötőszöveti és bazálmembrán alapanyagokat tartalmazó gélben (Matrigel, BD Laboratories) szuszpendálva pedig háromdimenziós, hexagonális elrendeződésű értubulusokat hoznak létre.

Kísérleteinkben a tubulusképzést coeliakiás és kontroll antitestek (anti-TG2 CUB7402,

izotípus kontroll) jelenlétében vizsgáltuk. A coeliakiás betegsavókból totál IgA frakciót és egy IgA hiányos coeliakiás beteg szérumából affinitás-tisztított TG2-specifikus coeliakiás IgG antitesteket preparáltunk (az IgA tisztítás technikai nehézségei miatt). Mindkét fajta coeliakiás antitest egyformán lecsökkentette az endotél sejtek valamint a képzett érszerű formációk hosszát (45. ábra), gátolta a sejtek migrációját és az aktin citoszkeleton

deformálódását okozta, míg a CUB7402 antitest ezeknek a tulajdonságoknak csak egy részét (migráció) befolyásolta hasonló mértékben. A humán endotél sejtek és egér embrionális mesenchymális sejtek (C3H/10T1/2) együtt tenyésztése során mind a coeliakiás antitestek, mind a CUB7402 mellett csökkent az angiogenesis.

A B C

Sejtelágazások hossza um/képmező)Sejtelágazások hossza um/képmező) Sejtelágazások hossza um/képmező)Sejtelágazások hossza um/képmező)

45. ábra. A coeliakia-specifikus IgA, IgG antitestek és egér monoklonális anti-TG2 antitestek (CUB7402) hatása endothél-mesenchymális sejtek együttes (A,B) tenyésztése során a képzett érformációk hosszára (A), a sejtek migrációjára (B) és csak endotél sejtekből álló tenyészet érképzésére (C). A CUB7402 hatása a kisérleti körülményektől függően változó, a coeliakiás IgA és affinitástisztított TG2-specifikus coeliakiás IgG hatása mindkét kísérleti rendszerben gátló volt.

Ezek a kísérletek arra hívták fel a figyelmet, hogy a coeliakia antitestek hatása sokkal komplexebb, mint a TG2 egyszerű gátlása. Felmerült az a kérdés is, hogy a coeliakiás szérumokban lévő egyéb (gliadin vagy aktin elleni) antitestek mennyiben felelősek ezekért a hatásokért. A TG2 antigénnel tisztított coeliakiás IgG antitestek hatása azonban egyezett a teljes IgA frakcióval nyert eredményekkel, így ez arra utal, hogy a fő hatásért a TG2 elleni antitestek felelősek. Az antitesttisztítás nehézségei miatt a további kísérletekben a teljes IgA mellett a hatás TG2 függőségének ellenőrzésére fág display segítségével klónozott monoklonális TG2 elleni egyláncú antitesteket alkalmaztunk.

Caja S, Myrsky E, Korponay-Szabó IR, Nadalutti C, Sulic AM, Lavric M, Sblattero D, Marzari R, Collighan R, Mongeot A, Griffin M, Mäki M, Kaukinen K, Lindfors K. Inhibition of transglutaminase 2 enzymatic activity ameliorates the anti-angiogenic effects of coeliac disease autoantibodies. Scand J Gastroenterol. 2010;45:421-7.

A HUVEC vizsgálatok érdekesnek tűntek az angiogenesisre gyakorolt hatás további részletes vizsgálatára és a kezdetben bonyolult kiértékelést egyszerűsítve és jobban standardizálva nagyobb számú független, finn és magyar coeliakiás betegsavóból tisztított antitest készítménnyel is sikerült a korábban észlelt hatást stabilan reprodukálni mind a kollagénes, mind a matrigeles rendszerben. A fágban kifejezett egyláncú antitestek közül (CD Mab) legmegfelelőbbnek a 4.1 klónt találtuk, ezzel az azonos TG2 epitópra kötődést független vizsgálatokkal is kimutattuk (72. oldal). A 4.1 klónnal végzett kiegészítő kísérletekben igazolni lehetett, hogy hatása és a coeliakiás IgA frakció hatása azonos és a TG2 fokozott extracelluláris aktivitásával jár. Az angiogenesisre gyakorolt hatást TG2 inhibitor (R283) gátolta. A gátlás a sejtekbe be nem hatoló R281 alkalmazásával is kiváltható volt. A sejtek össz TG2 tartalma Western blot szerint nem változott, így a TG2 enzimatikus működését fokozó antitesthatás elsősorban az extracelluláris térben látszik jelentősnek (46. ábra).

Tubulusok hossza (%)Tubulusok hossza (%)

TG2 aktivitás (%)TG2 aktivitás (%)

46. ábra. A coeliakiás IgA és egyláncú monoklonális coeliakia antitestek (CD Mab) hatása az angiogenesisre és a TG2 aktivitására endotél sejtkultúrában TG2 inhibitorok (R281, R283) jelenlétében, *p<0.001.

Myrsky E, Caja S, Simon-Vecsei Z, Korponay-Szabó IR, Nadalutti C, Collighan R, Mongeot A, Griffin M, Mäki M, Kaukinen K, Lindfors K. Celiac disease IgA modulates vascular permeability in vitro through the activity of transglutaminase 2 and RhoA. Cell Mol Life Sci. 2009;66:3375-3385.

Martucciello S, Lavric M, Tóth B, Korponay-Szabó IR, Nadalutti C, Myrsky E, Rauhavirta T, Esposito C, Sulic AM, Sblattero D, Marzari R, Mäki M, Kaukinen K, Lindfors K, Caja S. RhoB is associated with the anti-angiogenic effects of celiac patient transglutaminase 2-targeted autoantibodies. J Mol Med (Berl). 2012 Jan 6. Epub

A további két közleményben a fokozott TG2 aktivitás következményeit és az antitestek hatásának jelátviteli útjait vizsgáltuk. Egyrészt kimutattuk, hogy az endotél sejtek működésében más zavarok is kimutathatók: a coeliakiás antitestek hatására fokozódik a paracelluláris érpermeabilitás, a limfociták adhéziója és transzendoteliális migrációja és fokozódik az E-selectin expresszió. Ezek a hatások is fokozott extracelluláris TG2 enzimatikus aktivitással jártak, blokkolhatók voltak R281 TG2 inhibitorral és nem jöttek létre a TG2 aktivitást gátló CUB7402 antitest jelenlétében. A érbarriert károsító hatás jelentős lehet in vivo körülmények között és a vékonybélben zajló gyulladás fokozódásához vezethet. A vaszkuláris hyperpermeabilitás alapján a ras homolog gene family member (Rho) jelátviteli rendszer aktiválódását valószínűsítettük. A fokozott RhoA aktivitás gyári kittel is mérhető volt és C3 transzferáz endotoxin előkezeléssel, mely a Rho fehérjéket gátolja, a coeliakiás antitestek hatásai csökkenthetők voltak. A sejtfiziológiai ismeretek alapján elsősorban a RhoA aktivitásának fokozódása látszott valószínűnek, a második cikkben azonban kimutattuk, hogy az antitestek angiogenesist gátló fő hatásának hátterében inkább a RhoB anyagcsereút állhat. A C3 transzferáz mindkét Rho fehérjét gátolja, és az RhoA aktivitás mérésére forgalmazott kit a RhoB aktivitást is méri. A RhoB szerepére az endotél sejtekkel végzett RNS microarray vizsgálat hívta fel a figyelmet, ahol a RhoB fokozott expresszióját észleltük a fibronectin fokozódásával párhuzamosan és az integrin 1 csökkenés mellett. A RhoB fehérje mennyisége blot és immunfluoreszcens festés alapján is magasabb volt a coeliakiás antitestek jelenlétében az in vitro endotel modellben illetve egér bőre alá beültetett matrigelben, melyben kívülről bevitt humán endotel sejtekkel angiogenesist indukáltunk (47. ábra).

47. ábra. A Rho B mérése mRNS (A) és fehérjeszinten (B) az endotél modellben coeliakiás IgA antitestek illetve egyláncú monoklonális 4.1 coeliakiás (CD Mab) antitest jelenlétében, *p<0.05.

A RhoB termelés csendesítése interferáló RNS segítségével jelentősen mérsékelte a coeliakia antitestek jelenlétében észlelt differenciálódási és sejtmigrációs zavart, akár IgA frakciót, akár coeliakiás betegekből preparált egyláncú monoklonális 4.1 antitesteket használtunk, a RhoA csendesítése azonban nem. Ugyancsak kompenzálta a coeliakiás antitestek angiogenesist csökkentő hatását simvastatin hozzáadása, mely a RhoB megfelelő működéséhez szükséges poszttranszlációs módosítást (farneziláció) gátolja (48. ábra). Mivel a simvastatin általánosan használt gyógyszer a koleszterinszint csökkentésére, ígéretesnek látszik további vizsgálata, hogy képes-e mérsékelni a coeliakiával kapcsolatos vékonybél boholykárosodást.

A B

Endotél sejtek hossza (%)Endotél sejtek hossza (%)

Vándorló sejtek száma/képmezőVándorló sejtek száma/képmező

48. ábra. A coeliakiás IgA és egyláncú monoklonális coeliakia antitestek (CD Mab) hatása az angiogenesisre (A) és az endotél sejtek vándorlására (B) Rho fehérjéket csendesítő RNS és kontroll (scramble) RNS jelenlétében,

*p<0.0001, illetve a és b között a B panelen.