A coeliakiás antitestek keletkezése és biológiai hatásai

A coeliakia antitestek jellegzetes velejárói az aktív coeliakia betegségnek, de nem coeliakiásoknál nem fordulnak elő. A gliadin bevitel provokálja a deamidált peptidek elleni antitestek termelését, de az anti-TG2 keletkezése nem tisztázott; megjelenését a haptén-carrier elv alapján magyarázzák. A T-sejt epitópok általában lineárisak és nem azonosak a B-sejt illetve antitest epitópokkal. A TG2 coeliakia epitópja az antitestek számára az aktív betegség alatt illetve fagyasztott metszetekben jól hozzáférhető, ezt bizonyítja az in vivo kötődés és az EMA típusú diagnosztikus reakció. Tanulmányainkban kimutattuk, hogy monoklonális nem coeliakia eredetű anti-TG2 antitestek a deamidált gliadin peptideket is felismerik. A keresztreakció többféle kompeticiós vizsgálattal és coeliákiás tisztított páciens antitestekkel is alátámasztható. Mivel a peptidek primer aminosav szerkezete nem egyezik a TG2 szekvenciával, a jelenség háromdimenziós hasonlóságon alapul. Ezt a hasonlóságot alátámasztja az is, hogy a molekuláris modellezés és kristályszerkezeti mérések szerint a gliadin peptidek bizonyos poziciójában gyakori EPQL (a PQPQLPY deamidált változatában) motivum a HLA-DQ2 molekulába kötődéskor a fő coeliakiás epitóp 153-as és 154-es (és 431-es) aminosavának térbeli szerkezetére hasonlíthat, míg a kísérletesen igazolt EQ homológia

a TG2 más C-terminális területeivel is keresztreakcióhoz vezet. Ezen eredmények alapján a coeliakia antitestek megjelenésében a molekuláris mimikri is szerepet játszhat. Ez nem jelenti azt, hogy a haptén-carrier elmélet nem érvényesülhet, a kettő egymással kombinálódhat. Mindkét elméletben kulcsfontosságú szerep jut a TG2-specifikus B-sejteknek, mint a gliadint bemutató és ennek eredményeként a T-sejt által aktiválható nem professzionális antigénbemutató sejteknek. Ha a B-sejt specifitása megfelel a coeliakia epitópnak, akkor az annak mimotópjaként ható gliadin peptid a B-sejt felszíni immunglobulinjába közvetlenül is belekötődhet és nem csak a haptén (TG2) részen keresztül kerül felvételre. Emiatt a bekebelezési és prezentálási folyamat effektivitása megnőhet és az ilyen B-sejt preferenciális T-helper szignálokat kaphat a gliadinra specifikus T-sejtektől.

Ennek megfelelőan a bemutatott gliadinok szelekciója nem csak a DQ2/8 szintjén, hanem már a B-sejtbe való bekerüléskor is irányított lehet. A B-sejt (DQ) felé néző gliadin gyökök T-sejt válasszal kapcsolatos antigenitását megszabó jellegzetes elrendeződését (1.ábra) már kiterjedten vizsgálták, ezért sokkal érdekesebb, hogy a peptidekből a T-sejtek milyen motívumokat látnak. Ebből a szempotnból a prolingyűrűk látszanak fontosnak, és a legtöbb erősen immunogén peptidben ezekből 4 vagy 3 is található, tipikus távolságra. Ezért úgy tűnik, hogy maguk a T-sejtek is valamely szabályos szelekció vagy suppressziós hiány eredményei lehetnek. A korábbi genomikai vizsgálatok számos olyan humán gént azonosítottak, melyek a gliadinnal részben homológ szerkezetű részeket is kódolhatnak (Kumar és mtsai 2000). Ezek további kutatása indokoltnak látszik.

A coeliakia autoantitestek megkötődnek a célszervekben lévő TG2 felszínén. A tisztított coeliakiás anti-DGP antitestekkel azonban nem észleltünk sem EMA típusú, sem más jellegzetes festődést immunfluoreszcens vizsgálatainkban. Lehetséges, hogy ezek a vizsgálatok nem voltak technikailag elég érzékenyek, de az eddigi adatokból úgy tűnik, hogy az anti-DGP önálló biológiai aktivitása egyelőre nem igazolható. A tisztított teljes IgA frakcióval végzett vizsgálatokban észlelt hatások TG2-specifikus tiszított vagy monoklonális coeliakiás antitesttel is létrehozhatók voltak. Az anti-TG2 IgA (IgA hiány esetén IgM) antitestek lerakódása a szövetekben viszont minden coeliakiás betegre jellemző és kimutatása diagnosztikusan hasznosítható. Ez támogatja azt a nézetet, hogy az EMA típusú anti-TG2 antitestek közrejátszhatnak a coeliakia patológiai jelenségeinek kialakulásában.

Mivel a vékonybélen kívüli szövetekből ritkábban vesznek biopsziát és azt is csak nagyon jelentős klinikai manifesztációk esetén, nem meglepő, hogy az egyéb szövetekben megkötődött antitestek kimutatásakor e szervek betegsége is fennállt. Érdekes módon a placenta bolyhok a vékonybéllel analóg felszíncsökkenést mutattak, amely új megfigyelés.

Cerebelláris ataxiás betegeknél már korábbi vizsgálatokból ismert, hogy a legfontosabb eltérés a hipoxiára nagyon értzékeny Purkinje sejtek pusztulása és az erek körül kialakuló gyulladás (Hadjivassiliou és mtsai 1998, 2002). Saját antitest vizsgálatainkban pedig az

agyban is az anti-TG2 antitestek kisereken történő lerakódását észleltük (Hadjivassiliou és mtsai 2006).

A coeliakiás vékonybélben az anti-TG2 antitestek az érstruktúrák extracelluláris felszínén lévő TG2 fehérjéhez kötődnek, így mind a bélbolyhok vérellátását, mind boholyvázat merevítő működését zavarhatják. Cadaver vizsgálatokból régóta ismert, hogy aktív coeliakiában a vékonybélben lévő erek száma kevesebb, elrendeződése kóros és kimutattuk, hogy falukban kevesebb izomelem található (Myrsky és mtsai 2009a). A sejtkúltúrákban végzett kísérletekben a coeliakiás antitestek gátolták az angiogenesist és az endotél sejtek mozgását, mely az értubulusok képzéséhez fontos. Az értubulusok képződésének csökkenése jól reprodukálható volt a különféle vizsgálati rendszerekben és a TG2 fokozott katalítikus aktivitásával járt, mely megfelel az antitestek biokémiai hatásának.

Vizsgálatainkban a coeliakiás anltestek hasonló mechanizmussal in vitro fokozták a gliadin áthaladását a hámsejteken (Rauhavirta és mtsai 2011). A vaszkuláris permeabilitás is megnőtt, (Myrsky és mtsai 2009b), mely közrejátszhat gyulladásos folyamatos megindulásában. A vékonybél hipoxiás állapotát jelzi a hypoxia-indukált faktor 1 alfa (HIF1alfa)fokozott expressziója is (Vannay és mtsai 2010). Bár az érképződés egyes lépéseit más TG2 gátló antitestek is befolyásolták, ezek nem hozták létre az összes coeliakiára jellemző eltérést. További kísérletekkel igazoltuk, hogy a coeliakiás betegek antitestjei úgy kötődnek az enzimhez, hogy annak aktivitását fokozzák, és hogy ez a fokozódás elsősorban az extracelluláris TG2 működésére vonatkozik. Kimutattuk továbbá, hogy a megnövekedett TG2 hatására a RhoA anyagcsereút aktiválódik. Korábbi irodalmi adatok szerint az aktív RhoA hatására hasonló sejtkárosodás és motilitási zavar következik be, mint azt a kísérletekben észleltük. A konstitucionálisan aktív RhoA csökkenti a sejtproliferációt és a motilitást (Morin és mtsai 2009) valamint gátolja az endotél sejtek megfelelő polarizációjának kialakulását (Philippova és mtsai 2005).

Ezek az eredmények, összevetve azzal, hogy anti-TG2 antitestek gyakorlatilag minden coeliakiás betegben kimutathatók, a coeliakia antitestek fontos patogenetikai szerepét alátámasztják. A súlyos boholyatrófia kialakulásában betöltött direkt szerepük azonban további igazolásra szorul. Ennek kimutatása jelenleg nehéz, mivel nincs megfelelő állatmodell. Egy nude egereken végzett vizsgálatunk kezdeti eredményei azonban bíztatók.

Megfigyeltük továbbá, hogy az anyai IgG coeliakiás antitestek passzív transzportja esetén az újszülöttben magas antitest szint és a szövetekben IgG anti-TG2 lerakódás alakul ki. Az átkerült antitestek epitópspecificitása azonos volt az anya szérumában lévő antitestekével.

Egyes gyermekekben ezzel párhuzamosan klinikai tüneteket (hasmenés, májkárosodás) is megfigyeltünk, valamint az aktív coeliakiában szenvedő és szeropozitív anyák gyermekeinek születési súlya alacsonyabb volt. Direkt bizonyítékot azonban arra, hogy boholykárosodás is

létrejött volna, nem sikerült szerezni. A további kutatás szempontjából az látszik fontosnak, hogy az antitestekkel in vivo rendszerben is elérjünk valamilyen biológiai hatást, mivel már vannak specifikus inhibitoraink, melyekkel aztán eldönthető, hogy ez a hatás TG2 fehérjén keresztül jön-e létre illetve coeliakia jellegű-e. A simvastatinnal specifikusan gátolható a RhoA aktivációja, a MAb885 pedig magát az antitestkötődést tudja specifikusan gátolni. A MAb885 hatása érdekes, mert bár ugyanarra az epitópra kötődik, sem a TG2 enzimaktivitását nem befolyásolja, sem a tubulusképzést. A MAb885 és a coeliakiás antitestek együttes adásakor nem jön létre endotél sejteken a coeliakiás antitestek hatása.

Valószínűleg ez azzal magyarázható, hogy kötődési epitópja csak részlegesen egyezik meg a coeliakiás antitestek kötőhelyével, bár ez elegendő a kompeticióhoz. A MAb885 a coeliakiás szövetekről is képes leválasztani az oda in vivo megkötődött IgA antitesteket, így bizonyos terápiás potenciál is remélhető. Ennek elbírálásához azonban szükség van a sejteknél komplexebb biológiai rendszerekben való vizsgálatára.

Az a törekvésünk, hogy az anti-TG2 keletkezésének okaként valamely egyértelmű örökletes defektust találjunk, egyelőre nem járt eredménnyel, azonban ezek a vizsgálatok tovább folynak. Megállapítható, hogy a coeliakiás betegeknek olyan adottságai vannak, melyek fokozott T-sejtes válaszra vagy gyulladásra hajlamosítják őket. Azt, hogy a gliadinon kívül milyen egyéb triggerek lehetségesek, pontosan nem tudjuk, a toll-like receptorok fokozott primer expressziója bármilyen külső mikroba ellen fokozottabb reakcióval járhat. Érdekes, hogy ezeknek hajlamosító tényezőknek és genetikai variációknak a megoszlása populációnként változik. Ez arra utal, hogy magával a kórfolyamattal csak laza kapcsolatban vannak. A genetikai variációk közül három nem primeren immunsejtekkel kapcsolatos gén kiemelendő, mely általános sejtbiológiai jelentősége miatt érdekes lehet. Az integrin 4 alfa (ITGA4) és az lipoma-preferred partner (Lpp) protein a sejtek adhéziójában és motilitásában játszanak szerepet, a myosin IX pedig egy motoros fehérje mely a sejten belül egyes molekulák és vezikulák transzportjában vesz részt, amit többet között a Rho fehérjék is befolyásolnak. A sejtes kísérletekben a motilitási és adhéziós funkcióknak a változását észleltük coeliakiás antitestek jelenlétében, így ezeknek az anyagcserefolymatoknak a további vizsgálatát tervezzük a családi rizikóval született gyermekek köldökzsinórjából preparált sejteken.

6.4. Az antitestvizsgálatok szerepe a coeliakia új diagnosztikus kritériumainak