A transzglutamináz antitestek kimutatása és összehasonlítása

A coeliakia a hagyományos tankönyvekben enteropátiaként szerepel, a szövettani eltérések azonban nem specifikusak (Pallav és mtsai 2012), olyan gyulladásos vagy infektív kórképekben, mint virusfertőzések, nutritív allergia, autoimmun folyamatok is előfordulnak.

A coeliakia megkülönböztető jegye egy szabályos, lényegében mindig társuló humorális immunválasz a TG2 fehérje ellen. Vizsgálatainkkal igazoltuk, hogy az endomysium, reticulin, jejunális és transzglutamináz antitest elnevezések ugyanazt az egy gluten-dependens, biológiailag aktív antitestet jelölik, melyet különbözőképpen is kimutathatunk. Mindegyik kimutatásnak vannak előnyei: az EMA, ARA, JEA vizsgálati rendszerek a természetes TG2 enzim antigént tartalmazzák a szöveti környezetben, így humán szövet esetén nagyon specifikusak és tulajdonképpen olyan antigént ajánlanak fel, mint amilyennel az autoantitest in vivo találkozik. A tisztított rekombináns TG2 enzim viszont könnyebben kezelhető, egyszerűbb technikai feltételekkel is megvalósítható a mérés, és lehetőség van automatizálásra is. A problémát a mesterségesen termelt TG2 fehérjék térszerkezeti és stabilitási problémái okozhatják, mivel a specifikus és szenzitív kötődés csak megfelelő háromdimenziós konformációnál jön létre. Vizsgálatainkban a gyenge enzimaktivitású enzimekhez való rosszabb antitestkötődés (Tumpek és mtsai 2004) arról árulkodik, hogy ezeknek a fehérjéknek a térszerkezete nem volt megfelelő, a transzglutamináz aktivitás feltétele ugyanis egy megfelelő térbeli alakzat felvétele. Érdekes módon ez a probléma nemcsak érzéketlenebbé teszi a vizsgálati eljárást, hanem a specificitás is csökkenhet, mert a szérum antitestek nemspecifikusan is megtapadhatnak az „összegyűrődött” vagy aggregált rossz szerkezetű fehérjén. Ez az anti-TG2 mérések kezdeti időszakában jellegzetes probléma volt, és még ma is magyarázhat bizonyos eltéréseket az egyes gyári anti-TG2 kimutatási kit-ek között (Giersiepen és mtsai 2012). Az antitestkötődési tulajdonságok javíthatók, ha nem közvetlenül, hanem egy másik fehérje vagy antitest segítségével, egy megfelelően orientált helyzetben, valamely természetes kötőhelyénél fogva rögzítjük a TG2 antigént a lemezre. Ez az eljárás nemcsak a specificitást, hanem az érzékenységet és az epitóp hozzáférhetőségét is javíthatja (El Alaoui és mtsai 2006), és ez a magyarázata a rádioizotópos kimutatás nagyobb érzékenységének is (Giersiepen és mtsai 2012). Itt ugyanis az antitest kimutatása immunprecipitációval történik, ami azt jelenti, hogy az antigén és az antitest folyadék fázisban kapcsolódik össze: a kapcsolat erősebb, kevésbé vannak a kötődési partnerek deformációnak kitéve. A folyadékfázisú kimutatási rendszerek magas érzékenységét főként a glutenmentes diéta ellenőrzése kapcsán lehet kihasználni: sokkal tovább mutatják az antitest pozitivitást, mint a szokásos ELISA mérési eljárások (Candon és mtsai 2012). Az EMA és az anti-TG2 azonosságát a gyakorlatban jobban kellene hangsúlyozni, mert ez rámutat

arra, hogy az anti-TG2 kimutatásokat technikailag éppoly specifikussá kell fejleszteni, mint amilyen az EMA. Paradox módon ez a mikroszkópos értékelést kívánó eljárás jelenleg a legmagasabb specificitású. A coeliakia antitestek nagy mennyiségben vannak jelen a vérben a coeliakia kezeletlen állapotában, így egy viszonyleg egyszerű fluoreszcens eljárással is könnyen láthatóvá tehetők. A jellegzetes EMA mintázat látványa még halvány reakció esetén is nagyon meggyőző. A TG2-/- szövetekkel kapott eredményeink pedig azt mutatják, hogy a mintázatot más, TG2-től független specificitású antitestek nem utánozzák (Korponay-Szabó és mtsai 2003a). Az ELISA eredményeket csak egy számként látjuk, ahol nehéz a háttérreakciókat elkülöníteni és ezért az alacsony antitest szintet jelző eredmények diagnosztikusan sokkal kevésbé hasznosíthatók (Hopper és mtsai 2007, Kurppa és mtsai 2012). Meg kell azonban jegyezni, hogy a valóban jó minőségű antigént tartalmazó gyári ELISA-k, mint a Celikey™ teszt, az alacsony pozitív értékeknél is nagyon specifikusak.

A TG2-alapú diagnosztikus ELISA eljárások továbbfejlesztése jelentős számú új beteg felismerését tette lehetővé, mivel a coeliakia szerodiagnosztikája a korábbiaknál nagyobb méretekben, szélesebb körben, kisebb laboratóriumokban is elérhetővé vált. A kit-ek sokfélesége az antitestek diagnosztikus kritériumként való alkalmazását megnehezíti, és ezért az ESPGHAN irányelvekben a genetikai vizsgálatoknak és az EMA alkalmazásának jelentős szerepe marad, sőt az alacsony anti-TG2 szintek esetén továbbra is szükséges a szövettani vizsgálat elvégzése is. A cél a szokványos anti-TG2 ELISA eljárások specificitásának fokozása és az antigén minőségének mérése. Ennek jó eszköze lehet a coeliakiás TG2 epitópra specifikus MAb885 felhasználása, mely lehetőséget adna a különböző klinikai kit-ek standarizálására is. Az általunk alkalmazott gyors antitest kimutatás a beteg saját TG2 antigénjének használatával igyekszik az EMA előnyeit az anti-TG2 mérések egyszerűségével ötvözni. A beteg ujjbegy mintájából származó, friss, jó konformációjú természetes vörösvérsejt TG2 antigénnel az antitest folyadékfázisban reagál és a komplexet egy természetes szövetkörnyezethez hasonló kötőszöveti fehérjekomplex (gelatin) köti a tesztkit felszínére, mely az EMA eljárásra hasonlít. Az antitestet bárki láthatja, és ezt az információt azonnal felhasználhatja. Mivel magában a kit-ben nincsenek hőre vagy tárolási körülményekre érzékeny komponensek, a betegből származó TG2 antigénnel trópusi körülmények között vagy specializált laboratóriumoktól távol is fel lehet ismerni az antitesteket (Crovella és mtsai 2007, Demirçeken és mtsai 2008, Kotze és mtsai 2009, Laadhar és mtsai 2011).

Az általunk készített gyorsteszttel egyidőben más gyors anti-TG2 kimutatási eljárások is megjelentek (Ferre-Lopez és mtsai 2004, Nemec és mtsai 2006). Alkalmazásuk egyszerűsége megnövelte a vizsgálható betegek számát és hasznosnak bizonyult a klinikai esetfelismerésben és a szűrővizsgálatok gyors kivitelezésében (Demirçeken és mtsai 2008,

Alarida és mtsai 2011). A laboratóriumokban végzett népességszűrési tanulmányokban jelentős költséget, időt és szervezést igényel a minták begyűjtése, szállítása és feldolgozása.

Az egyik legnehezebb feladat a kiszűrt pozitívak visszahívása, ami több hónap után már kevésbé effektív. Hónapok alatt a glutenbevitel is változhat, nehezebbé válhat a diagnózis igazolása (Hogen Esch és mtsai 2010). A 2005-ös szolnoki szűrővizsgálatban a helyszíni pozitivitás után már 3-4 nappal megtörténtek a vékonybélbiopsziás vizsgálatok és ezért jó volt a betegek részvétele a megerősíti vizsgálatokban is (Korponay-Szabó és mtsai 2007). A coeliakia gyorsteszt segítségével az eredmények nemcsak gyorsabban állnak a vizsgáló orvos rendelkezésére, hanem a szűrő jellegű első vizsgálat nemcsak orvos vagy egészségügyi személyzet, hanem maga a beteg által otthon is elvégezhető. Az ujjbegyből végezhető teszt kisebb megterheléssel alkalmazható kisgyermekeknél, mint a hagyományos, vénából történő vérvétel a savóvizsgálatokra. A gyorsteszttel végzett ellenőrzés, és a kóros eredmény alapján végzett intervenció és diétás tanácsadás javítja a diétás fegyelmet és betegek kezeltségi állapotát (Korponay-Szabó és mtsai 2005), valamint lehetővé teszi a családtagok minimálisan invazív szűrését (Raivio és mtsai 2006). Bár az antitest mérések működésének metaanalízise során a gyorstesztek jó működési tulajdonságokat mutattak, sok országban a laikusok által történő használatot az orvosok ellenzik. Ez attól is függ, hogy a felhasználó milyen információkat kap a teendőkről egy pozitív teszt eredmény esetén.

Nagyon fontos, és a teszt utasításában ki kell hangsúlyozni, hogy diétát a szakszerű orvosi kivizsgálás megtörténtéig nem szabad elkezdeni.

Az anti-TG2 antitest meghatározások ma már napi rutinná váltak, de még mindig nehéz az IgA hiányos betegek számára megfelelő teszteket választani. Az IgA hiányos személyeknél az IgG TG2 antitestek hasonlóan viselkedtek, mint normál IgA szint esetén az IgA TG2 antitestek, és klinikai jelentőségük is azonos volt. Az IgG TG2 antitestek gluten-dependens jellege szintén igazolható volt. Ez alátámasztja azt, hogy az IgA hiányos coeliakiás betegeknél ugyanannak a betegségnek a spektrumát látjuk, csupán technikailag nehezebb a diagnózis.

Mivel elvi különbség nincs, a diagnosztikus folyamatnak sem kell különböznie. Az IgG anti-TG2 antitest mérése első vonalbeli neminvaziv vizsgálatként alkalmazható, és negativitása esetén nem kell rutinszerűen vékonybélbiopsziát végezni IgA hiányos betegeknél sem. Az IgA és IgG TG2 antitest vizsgálat együttes alkalmazhatóságát populációszűrési vizsgálatok során is bizonyították (Tommassini és mtsai, 2004). Az IgG vizsgálatok terjedése és hatékonysága nevelő hatással is volt, mert korábban a rutin IgA antitestmérések mellett nem mindig történt meg a szérum IgA szint mérése sem a klinikai gyakorlatban, sem szűrővizsgálatoknál. Az IgA hiány felismerése kritikus a gyorsteszttel végzett antitest kimutatásnál, ezért kezdettől arra törekedtünk, hogy a coeliakia antitest és az össz IgA kimutatást egyszerre végezzük. A kereskedelemben kapható teszt ezt az igényt lassabban követte, de a második generációs formában már mindkét kimutatási lehetőség

rendelkezésre áll. Más gyorstesztekben az IgA és IgG anti-TG2 kimutatás kombinációját alkalmazták (Ferre-Lopez és mtsai 2004). Az IgA és IgG anti-TG2 kimutatás magas specificitása miatt a sokkal gyengébb specificitású hagyományos gliadin antitest vizsgálatok fokozatosan kiszorultak a klinikai diagnosztikából. A deamidált peptidek elleni antitesteknél viszont még normál szérum IgA szint esetén is az IgG anti-DGP eredmények érzékenyebbek és specifikusabbak (Giersiepen és mtsai 2012), mint az IgA anti-DGP antitest eredmények. Ez arra hívja fel a figyelmet, hogy keletkezésükben a mukozális immunredszer másképp vesz részt, mint az anti-TG2 és EMA antitestek termelésében.

A szérumból történő antitestvizsgálatokat kiegészítik a vékonybélből vagy más szervekből végezhető antitestvizsgálatok, melyek közvetlenül a szövetekhez kötött antitesteket mutatják ki. Ez főként akkor jelentős, ha a szérumban az antitestek nem mutathatók ki (Salmi és mtsai 2006b). Egy másik alkalmazás a coeliakia korai eltéréseinek értékelése, ahol a szövetekbe lerakódott IgA már előbb kimutatható volt, mint a boholyatrófia.

Tanulmányunkban 48 betegen azt vizsgáltuk, hogy az első klinikai kivizsgáláskor látszólag normál vékonybél boholyszerkezetű betegeknél milyen a későbbi kimenetel. Ezeknél a betegeknél a vérben nem vagy csak alacsony koncentrációban voltak jelen anti-TG2 antitestek. A vékonybélbe lerakódott anti-TG2 antitestek jelenléte esetén több év után nagy valószínűséggel jelent meg klasszikus boholyatrófia, így ezek az eltérések prediktív értékűek (Koskinen és mtsai 2008a). A bélrendszeren kívüli szövetekben a TG2-specifikus antitestek jelenléte feltárhatja e szervek részvételét a gluten-szenzitív betegségekben és lehetőséget ad addig ismeretlen eredetű és emiatt nem gyógyítható szervi manifesztációk (májbetegség, szívbetegség, lymphadenopathia) hatékony kezelésére a gluten eliminációjával.