A coeliakia autoantitestek hatása a transzglutamináz enzimatikus működéseire

Király R, Vecsei Z, Deményi T, Korponay-Szabó IR, Fésüs L. Coeliac autoantibodies can enhance transamidating and inhibit GTPase activity of tissue transglutaminase: dependence on reaction environment and enzyme fitness. J Autoimmun. 2006;26:278-287.

A korai közlemények (Esposito 2002, Schuppan 2003) alapján kezdetben az a nézet uralkodott, hogy a coeliakiás antitestek a CUB7401 monoklonális egér antitesthez hasonlóan a TG2 protein-keresztkötő aktivitását gátolják. Ezeket a vizsgálatokat teljes IgA és IgG frakciókkal vagy egyláncú antitestekkel és sejtlizátumban történő TG2 aktivitásméréssel nyerték. Saját vizsgálatunkban ezért azt tűztük ki célul, hogy 1/ tisztított enzimen mérjük a hatást, 2/többféle reakciót és szubsztrátot vizsgálunk meg, 3/ a betegminták TG2-specifikus antitesttartalmára normalizáljuk az eredményeket, 4/affinitástisztított antitesteket is értékelünk különböző klinikai manifesztációval jelentkező betegcsoportokban. A vizsgálatokat korai malabszorpcióval jelentkező coeliakiás gyermekek (n=5), enterális

tünetek nélkül dermatitis herpetiformis miatt diagnosztizált gyermekek (n=5), súlyos tünetekkel (n=5) vagy családszűréssel (n=5) diagnosztizált felnőttek és IgA hiányos betegek (n=5) valamint normál kontrollok (n=3) alkalmazásával végeztük. Az enzimreakcót ELISA-lapon immobilizált dimetil-kazeinbe történő amin-beépítéssel, ammónia felszabadulását mérő folyékony fázisú esszével és rádioaktív putrescin beépítés vizsgálatával egyaránt mértük. Esposito vizsgálataihoz hasonló körülmények között, NB4 sejtekben expresszált TG2-tartalmazó sejtlizátumhoz putrescint adva, mi is többnyire mérsékelt gátlást észleltünk a coeliakiás antitestek jelenlétében, de ha rekombináns TG2 enzimet vagy magával az enzimmel tisztított antitestfrakciókat használtunk, jól reprodukálhatóan fokozott TG2 antivitást lehetett mérni többféle mérési eljárással is. A legkifejezettebb aktiváló hatást (125-242%) a súlyos felszívódási zavarral a korai gyermekkorban manifesztálódó betegek antitestjeinél észleltük, mely arányos volt a specifikus antitestek koncentrációjával, diéta mellett eltűnt és mind a folyékony fázisú mérési rendszerben, mind ELISA lapra kötött dimetil-kazein szubsztrát alkalmazásával mérhető volt. Ez az aktiváló hatás jellemző volt a súlyos tünetekkel jelentkező felnőttekre is, szemben azokkal, akiknél enyhe tünetek vagy családszűrés folytán derült ki a coeliakia fennállása (42. ábra).

Relatív aktivitás(%) Relatív aktivitás(%)

Kiindulási aktivitás antitestek nélkül (ΔAbs/min/mg)

TG2 aktivitás antitestek jelenlétében

B

Kiindulási aktivitás antitestek nélkül (ΔAbs/min/mg)

TG2 aktivitás antitestek jelenlétében

Kiindulási aktivitás antitestek nélkül (ΔAbs/min/mg)

TG2 aktivitás antitestek jelenlétében

B

42. ábra. A. Súlyos klinikai tünetekkel jelentkező coeliakiás gyermekek (E IgA) és felnőttek (S IgA) valamint családszűréssel diagnosztizált felnőttek (A IgA) tisztított TG2-specifikus antitestjeinek hatása a fibronectin felszínére kötött rekombináns TG2 enzim transzamidáló hatására. Az aktiváló hatás glutenmentes diéta után már nem mérhető. B. Az E csoport antitestjeinek aktiváló hatása az enzim bazális aktivitásának függvényében.

A totál IgA (IgG) frakcióval történő méréseknél kimutattuk, hogy az abszolút immunglobulin érték helyett a tisztított frakció TG2-specifikus antitest tartalmára normalizált eredmények adnak csak összehasonlítható értékeket: ilyen körülmények között az enyhe klinikai tünetekel diagnosztizált idősebb gyermekek és felnőttek, valamint az IgA hiányos betegek antitestjeivel is homogén aktiváló hatást mutattunk ki, míg a CUB7401 antitest minden mérési szituációban szinte teljes mértékben gátolta a TG2 aktivitást. Későbbi vizsgálataink igazolták, hogy a vizsgált betegminták mind a TG2 összetett (REM) epitópjára voltak specifikusak, míg a CUB7401 más TG2 epitópot ismer fel.

Az enzimre gyakorolt aktiváló hatás biokémiai vizsgálata során különböző szubsztrátok alkalmazásával kimutattuk, hogy a coeliakiás antitestek az enzimreakció mindkét fázisát, a

tioészter képződést és a keresztkötés kialakulását is gyorsítják, vagy megfelelő amin acceptor hiányában a deamidálást fokozzák. Az enzimaktivitás „fokozásának” mibenléte érdekes kérdés volt. A kiegészítő vizsgálatok arra utaltak, hogy ez valószínűleg a szerkezet stabilizálásából adódik. Az enzim igen érzékeny, hosszabb inkubálási idő után fokozatosan elveszti aktivitását, míg az antitestek jelenlétében tovább képes dolgozni. Ez a stabilizáló hatás függ az enzim eredeti állapotától: ha az aktivitás eleve magas, azt az antitestek már nem tudják tovább fokozni, de a közepes vagy gyengébb aktivitású enzimet stabilizálhatják (42. ábra). Mivel az ismételten igazolható volt, hogy a TG2 a megkötött antitestek jelenlétében is folyamatosan felhasználja a szubsztrátokat és tovább gyártja a reakcióterméket, ezek a vizsgálatok még a coeliakia epitóp azonosítása előtt jelezték, hogy a coeliakia antitestek primer kötőhelye nem lehet az enzim aktív centruma. Annak igazolását, hogy az antitestek valóban kötve vannak az enzimhez a reakció alatt, úgy végeztük, hogy TG2 enzimet fibronectinnel fedett ELISA laphoz adtuk, mely az extracelluláris viszonyokat utánozza. Ezután inkubáltuk az enzimet az antitestekkel és az enzimreakció indítása előtt kimostuk a meg nem kötődött nemspecifikus IgA/IgG-t. Hasonló rendszerben igazoltuk, hogy a coeliakia antitestek nem csak a rekombináns TG2 fehérjét képesek aktiválni, hanem NB4 sejtek lizátumából a fibronectines lemezen megkötődött és így tisztított természetes TG2 enzimet is. Ezért az antitestek jelenlétében kialakuló csökkent enzimaktivitásért a sejtlizátumban jelen levő egyéb sejtkomponensek vagy fehérjék lehetnek felelősek. Az intakt sejtes rendszerekben a TG2 meghatározott kompartmentekben van jelen és főként az extracelluláris matrixban a fibronectin felszínén aktív. A fibronectinhez kötött enzimmel kapott eredmények az in vivo viszonyokra nézve sokkal relevánsabbnak látszanak, mint a szétroncsolt sejttartalommal való mérések. Folyékony fázisban történő enzimreakció esetén nemspecifikus csökkenés vagy fokozódás is előfordulhat, a konkrét kötődési partenerektől függően. Ezek az eredmények összhangban vannak azokkal a korábbi megfigyelésekkel, hogy a vékonybélben a coeliakia aktív fázisában fokozódik a TG2 expressziója és aktivitása (Esposito és mtsai 2001), és magunk is szövetmetszeten végzett immunfluoreszcens vizsgálatokkal a primer aminok beépülésének fokozódását tudtuk kimutatni. A későbbiekben mások is kimutatták, a mi általunk alkalmazottól eltérő körülmények között is, hogy az antitestek kötődése nem gátolja meg a keresztkötések létrejöttét (Dieterich 2003), így nem valószínű, hogy a coeliakia antitestek primeren a TG2 gátlásával fejtenék ki hatásukat. Az enzim működésének fokozódását a továbbiakban leírt sejtes modellek vizsgálatakor is észleltük (Myrsky és mtsai 2009b, Caja és mtsai 2010, Martucciello és mtsai 2012).

Méréseinkben a coeliakia antitestek más hatásaként a GTP-áz működés mérsékelt csökkenését észleltük (67-73.4%-ra). Ennek in vivo relevanciája még nem eldöntött, mivel nem biztos, hogy az autoantitestek a sejten belüli TG2 fehérjéhez kapcsolódni tudnak.