Az összetett epitóp horgonyzópontjainak relatív szerepe az extracelluláris matrixban

A TG2 enzimatikus működése során jelentős konformációváltozásokat végez az extracelluláris matrixban, ahol fibronectinhez kötött formában található. A nyitott formában a C-terminális domén eltávolodik, és így a 659-as aminosav is, ezért azt vizsgáltuk, hogy a coeliakia antitestek hogyan ismerik fel a fibronectinhez kötött enzimet. Ha a mutáns TG2 fehérjéket fibronectinnel fedett ELISA laphoz adtuk, majd így ismertettük fel a coeliakiás antitestekkel, a coeliakiás antitestek jól kötődtek az M mutánshoz is, azaz az epitóp C-terminálison lévő része ilyen körülmények között nem okvetlen fontos a kötődéshez. Ennek megfelelően az RE és REM mutáns között nem volt mérhető különbség (31. ábra E), és a vizsgálatok azt igazolják, hogy a coeliakia antitestek az enzim nyitott formájában is kötődhetnek, megkötődve maradhatnak. Ennek közvetlen ellenőrzésére 20 savóminta és 3 affinitás-tisztított TG2-specifikus coeliakiás IgA antitest kötődését vizsgáltuk fibronectinhez kötött vad TG2 enzimmel R281 inhibitor jelenlétében, mely bekötődése után a nyitott konformációban kimerevíti az enzimet. A kötődésben nem volt különbség (33. ábra).

33. ábra. Coeliakiás IgA antitestek (20 savóminta és 3 affinitás-tisztított TG2-specifikus IgA) kötődése a TG2 zárt és nyitott konformációjához. A nyitott TG2 konformációt R281 aktív hely specifikus inhibitorral állítottuk elő, majd az enzimet ennek jelenlétében adtuk fibronectinnel fedett ELISA laphoz. Az inhibitor jelenlétében a fibronectinhez történő kötődés azonos hatásfokú volt, mint nélküle.

Annak vizsgálatára, hogy a 19-es és 153-as aminosav a betegségfolyamatban közvetlenül részt vevő antitestek számára is fontos-e, a coeliakiás szövetekből kinyert IgA antitestekkel

végeztünk kötődési vizsgálatokat. A szövetekben lerakódott antitestekről az előzőekben kimutattuk, hogy azok az extracelluláris TG2 antigénhez kötődnek és azzal együtt, a fibronectin-TG2 kapcsolat szétválasztásával ható kémiai anyagokkal (KSCN, klóracetát) kioldhatók. Két aktív coeliakiában szenvedő nő placenta szövete elegendő mennyiségben állt rendelkezésre a kísérletekhez. Ezekből a lerakódott IgA antitesteket megtisztítottuk és a szérum antitestekhez hasonlóan elvégeztük a mutánsokkal az epitóptérképezést. A szöveti antitestek a szérum antitestekhez hasonlóan nem tudtak az RE és REM mutánsokhoz kötődni (2. melléklet 6. ábra). Kimutattuk továbbá, hogy egy olyan monoklonális egér anti-TG2 antitest, melynek epitópját a 153-as glutaminsavra lokalizáltuk (MAb 885), képes volt a coeliakiás szövetben megkötődött IgA antitesteket önmagában is leválasztani a placenta metszetekről, és a TG2-specifikus IgA antitestek az inkubációs pufferben is megjelentek (Simon-Vecsei és mtsai 2012). Az IgA kimutatást a mosófolyadékból az egér antitestek Protein G-konjugált mágneses gyöngyökkel való eltávolítása után, ELISA lemezre kötött vad típusú TG2 antigénnel végeztük. A kompeticiós hatást más epitópspecifitású (CUB7402) anti-TG2 vagy izotípus kontroll monoklonális antitestekkel nem lehetett létrehozni (34. ábra).

Ezek a vizsgálatok azt igazolták, hogy az azonosított összetett coeliakia epitóp az antitestek in vivo, betegségfolyamat alatti kötődésében is meghatározó jellegű.

Puffer Puffer+IgG1

Puffer+CUB Puffer+885 0.0

0.5 1.0 1.5

IgA kötődésOD450

Puffer Puffer+IgG1

Puffer+CUB Puffer+885 0.0

0.5 1.0 1.5

IgA kötődésOD450

34. ábra. Coeliakiás placenta szövetben lerakódott IgA antitestek (zöld) CUB7402 vagy MAb 885 monoklonális egér TG2 antitestek (piros) hozzáadása után. FITC-jelölt antihuman IgA festés és AlexaFluor594-jelölt anti-egér immunglobulin festés, jobboldalt ELISA mérés rekombináns vad TG2 enzimmel a mosófolyadékból. A nyílak a magzati chorionbolyhokon megkötődött anyai IgA antitesteket jelölik.

5.4.6. Az összetett TG2 epitóphoz való direkt antitestkötődés vizsgálata

Mivel a coeliakiás antitestek kötődésének csökkenése többféle mutációval is elérhető volt valamint a saját vizsgálatainkkal párhuzamosan különféle ellentmondó irodalmi közlések is megjelentek, melyek a coeliakia kötőhelyet a molekula épp ellenkező oldalán sejtették (Byrne és mtsai 2006, Teesalu és mtsai 2011, Wang Z és mtsai 2012b), fontosnak tartottuk azt megállapítani, hogy a REM mutáció valóban az antitestek kötőhelyét érinti, és nem

indirekt módon, a térszerkezet deformálásával változtatja meg egy távoli kötőhely konformációját. Vizsgálatainkkal igazoltuk, hogy az aktív helyet érintő legcsekélyebb változás is, amely még nem okoz csökkenést az antigenicitásban (C277S mutáció), már szerkezeti eltéréshez vezet a hélixek arányában (32. ábra), így az aktív hely mindhárom aminosavának cseréje (Byrne és mtsai 2006) nagy valószínűséggel indirekt módon, a konformáció torzításával okozta a coeliakiás antitestek kötődésének elvesztését. Habár a CD spekroszkópia a mi mutánsainknál nem mutatott ilyen eltérést, hasonló mechanizmus a mi mutánsainknál is előfordulhatott. A R19S mutáció megtartott transzamidáló képességgel jár, amellett ennek az aminosavnak a cseréje önmagában nem minden betegsavó kötődésének csökkenésével járt (31. ábra C és D), így nem valószínű, hogy térszerkezeti deformitást okozna. Hasonlóan, a M659 mutáció egyedül még jó kötődést tesz lehetővé, ha a TG2 fehérje fibronectin felszínéhez van kötve. Ezért a továbbiakban azt vizsgáltuk, hogyan igazolható, hogy a coeliakia antitestek tényleg a core doménen lévő fő horgonyzópont, a 153-as aminosav közelében kötődnek. A core doménnek ez a területe az állati TG2 fehérjékben nagyfokú homológiát mutat azokban a fajokban, melyekből készített antigénekkel (tengerimalac, patkány, majom) jó hatásfokkal fel lehet ismerni a coeliakiás antitesteket ELISA vagy immunfluoreszcens vizsgálatokkal. Ugyancsak hasonló a TG6 szerkezete is, de a gyenge antigenitású transzglutamináz fehérjékben (TG1, TG3, Band 4.2 fehérje) eltérnek az aminosavak (2. melléklet S1 táblázat). A legfontosabbnak látszó eltérés a XIII-as faktorban található, amely a TG2 154-es glutaminsavának megfelelő 199-es helyen egy bázikus lizint tartalmaz, és amelyet a coeliakiás antitestek nem ismernek fel (Sjöber 2002). A XIII-as faktor kristályszerkezete ismert és azt a TG2 kristályszerkezetével összehasonlítva (35. ábra) azt mutatja, hogy felszínnek ez a része a két oldallánc különbözőségétől eltekintve lényegében azonos, és hogy ezt a két oldalláncot nem kötik hidrogénkötések más felszíni szerkezethez.

A B C

TG2 XIII-as faktor

TG2 XIII-as faktor

35. ábra. A humán TG2 (A) és XIII-as faktor (B) szerkezetének összehasonlítása. Az egymásra vetített kristályszerkezeti ábrán (C) a TG2 coeliakia epitóp körüli felszínét sárga, a XIII-as faktorét fehér gömb-pálcika modell jelöli.

A korábban létrehozott E154Q mutáns, mint azt az előzőekben bemutattuk, megtartott antigenitással rendelkezik. Ez azt bizonyítja, hogy az eredetileg savanyú glutaminsav oldallánc semleges glutaminra való cseréje nem jár szerkezeti változással. Az E154Q mutáns transzamidáló képessége is megtartott. Amikor azonban ezt az oldalláncot a XIII-as faktorra jellemző lizinre cseréltük (E154K), az E153S cseréhez hasonló, jól mérhető csökkenés jött létre a coeliakia antitestek kötődésében is, és ez tovább fokozható volt, ha a mutációt az R19S és M659S cserével is kombináltuk (RKM, 36. ábra). Ez az eredmény arra utal, hogy a core domén első héixének tetejét képező 153-as és 154-es aminosavak valóban a kötőhely részét képezik.

Relatív kötődés (%) Relatív kötődés (%)

36. ábra. A coeliakia IgA antitestek (n= 20 gyermek savó, fekete oszlopok, 18 felnőtt savó, szürke oszlopok) kötődése a XIII faktor homológ TG2 mutánsokhoz. 154K = E154K, E = E153S, RKM = R19S-E154K-M659S, REM = R19S-E153S-M659S.