Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak
a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen
Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
ALAPISMERETEK
a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen
Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Dr. Pongrácz Judit
Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 1. Előadás
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A kurzus célja
Elméleti háttérismeretek komplex szövetkultúrák előállításához
A kurzus tartalma
Hét Előadás Cím
1 1 Alapismeretek
2 Őssejtek (1)
2 3 Őssejtek (2)
4 Őssejtek (3)
3 5 Bioreaktorok (1)
6 Bioreaktorok (2)
4 7 Bioanyagok (1)
8 Bioanyagok (2) 5 9 Scaffold előállítás
10 Biokompatibilitás
6 11 Sejt-Scaffold kölcsönhatások 12 Biofaktorok
7 13 Szabályozott hatóanyag leadás 14 Bioszenzorok
Hét Előadás Cím
8 15 Aggregációs kultúrák
16 Szövetnyomtatás - Tissue printing 9 17 Tissue repair (1)
18 Tissue repair (2) 10 19 Tissue repair (3) 20 Tissue repair (4)
11 21 Kereskedelmi forgalomban lévő termékek (1) 22 Kereskedelmi forgalomban lévő termékek (2) 12 23 Klinikai kipróbálás (1)
24 Klinikai kipróbálás (2) 13 25 Klinikai kipróbálás (3)
26 Kutatási felhasználás és drogteszetelés 14 27 Etikai kérdések
28 Gazdasági jelentőség
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Mi a „tissue engineering”?
• „Tissue engineering” eredetileg a biológiai
anyagtudományok és a mérnöki tudományok egyik
mellékágaként jött létre, de mivel az utóbbi időben mind jelentősége, mind művelőinek száma megnőtt, ma már önálló tudományágnak számít.
• A „tissue engineering” célja specifikus szövetek, illetve akár teljes szervek regenerálása valamint újra-előállítása, a
biológiai funkciók megtartása vagy helyreállítása (csont, porc, ér, lép, bőr, stb.) mellett.
• Ennek érdekében különböző technikák kombinációit
használja: sejttenyésztés, bioanyagok szintézise, biokémiai és biofizikai módszerek.
A „tissue engineering” alapjai
Monolayer sejtkultúra Felszaporodott
sejtkultúra Graft előállítása
Biopszia vagy reszekció
útján nyert sejtek
Beültetés Biopszia
3D tenyésztés („scaffold”-on vagy
anélkül)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
2D szövetkultúra
Adherens Nem adherens
Szuszpendálás
Pelleting
Reszuszpendálás
Sejtek kirakása
Tripszin Tripszin nélkül
3D szövetkultúrák
Elégtelen diffúzió Apoptotikus sejthalál Másodlagos nekrózis
Nekrotikus szövet
Tápanyagok és oxigén diffúziója
Egészséges szövet
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szövetek előállítása
In vitro
• Szöveti regeneráció (szövet proliferáció és regeneráció mesterséges „scaffold”-on)
• Bio-mesterséges szervek (máj, bőr, hasnyálmirigy)
In vivo
• Vérsejt regeneráció (őssejt proliferáció és differenciáció stimulálása)
• Sejtinjektálás sérült
szövetekbe (szívizomsejtek)
• Nagy sérülések regenerációja (biológiailag abszorbeálható
„scaffold”-ok növekedési faktorokkal illetve nélkül)
Bioreaktor
• Nekrózis elkerülésére
Kevertetett bioreaktor
Perisztaltikus pumpák
Motor Bemenő víz
Kimenő víz
Levegő Ellennyomás
szelep
Elektromágneses szelep hűtéshez
Pumpa
Biztonsági szelep
Szabályozó egység Fűtőszál
Sav Habzás- Bázis gátló
Szubsztrát
Q
Q szelep Hab
T pH pO2
Ipari bioreaktor
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejt- és szövetpótló terápia fő alkalmazási lehetőségei
• Stroke
• Traumás agysérülés
• Alzheimer kór
• Parkinson kór
• Foghiány
• Sebgyógyulás
• Csontvelő transzplantáció
• Gerincvelő sérülés
• Oszteoarthritis
• Rheumatoid arthritis
• Kopaszság
• Vakság
• Süketség
• Miokardiális infarktus
• Muszkuláris disztrófia
• Diabétesz
• Multisite daganat
• Amiotrófiás laterális szklerózis
A „tissue engineering” során használt sejtek
Őssejtek
• Embrionális
• Köldökzsinórvér
• Csontvelő- vagy zsírszövet-eredetű
• Felnőtt, szövetspecifikus Érett, differenciálódott sejtek
• Szövetspecifikus
ŐSSEJTEK (1)
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak
a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen
Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Dr. Pongrácz Judit
Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 2. Előadás
Őssejtek
• Totipotens
• Pluripotens
• Multipotens
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Őssejt típusok
Idegsejtek
Vérsejtek Tenyésztett
őssejtek 8 sejtes
embrió Megtermékenyített
petesejt
Totipotens
Blasztociszta
Pluripotens
Multipotens
Agy Idegsejtek Csontvelő Vérsejtek
Multipotens
Az őssejt osztódásának típusai I.
Aszimmetrikus osztódás, differenciáció
Szimmetrikus, osztódás, differenciáció Szimmetrikus
osztódás
Őssejt
Leánysejt Önmegújító
leánysejt
Önmegújítás
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az őssejt osztódásának típusai II.
Proliferációs képesség
Differenciációs képesség
Véglegesen differenciálódott sejtek Őssejt
Proliferálódó szakasz
Aszimmetrikus osztódás Sejtszám megsokszorozódás Progenitor sejteken át történő
differenciáció
Őssejt források
• Felnőtt (szomatikus) őssejtek (Adult Stem Cells, ASC)
• Felnőtt multipotens őssejtek
• Embrionális őssejtek (ESC)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Epiblaszt őssejtek (EpiSC) I.
Az epiblaszt olyan szövet, amely az embrionális őssejtek kialakulását követő későbbi fejlődési szakasz során jön létre. Kialakulása az embrió beágyazódása után történik.
Epiblaszt őssejtek (EpiSC) II.
Primordiális ivarsejtek(GSC)
Megtermékenyítés
Szedercsíra
Embrionális őssejtek (ESC)
Epiblaszt
Késői blasztociszta
Epiblaszt őssejtek (EpiSC)
Szomatikus sejtvonalak
• Endoderma
• Mezoderma
• Ektoderma
IPS sejtek
Dedifferenciáció Újraprogramozás Embrionális
ivarsejtek (EG)
Extraembrionális endoderma (XEN) sejtek
Primitív endoderma
Trofoblaszt őssejtek (TS)
Trofektoderma (TE)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A multipotens felnőtt szomatikus őssejtek lokalizációja
Korábban azonosított:
A közelmúltban gyakorlatilag minden szövetben mutattak ki
őssejteket Agy
Bőr Csontvelő
Felnőtt (szomatikus) őssejtek (ASC)
A mikrokörnyezetet, ahol az őssejtek elhelyezkednek, őssejt „niche”-nek nevezzük
Zsírszövet-
eredetű őssejtek Perifériás vér Csontvelő Vázizomzat Méhlepény Szőrtüsző
Porc Csontvelő Porc Harántcsíkolt izom Csontvelő Bőr
Izom Ideg Ín Simaizom Ideg Agy
Csont Vérsejtek Izom Szív Porc Simaizom
Ideg Zsír Csont Ín Zsír
Máj Zsír Vérsejtek
Csontvelő Porc
Agy/Ideg Vér Szív Minden szövet
ASC:
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A felnőtt őssejt niche
Mikrokörnyezetként leírt őssejt niche-k:
Gasztrointesztinális Agy Csontvelő
Nyelőcső Agy Cornea
Vékonybél Idegek Retina
Vastagbél/colon Vérsejtek Hasnyálmirigy
Gyomor Izom Máj
Minden szövet Szív
Tüdő
Spermatogónium Amnion folyadék Köldökzsinór mátrix
Köldökzsinór-vér Különböző szövetek
Csontvelői őssejtek (MSCs)
• Hemopoetikus őssejtek
• Mezenchimális őssejtek
• Csontvelői stróma őssejtek
• Endotél progenitor sejtek
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Hemopoetikus őssejtek (HSC) I.
ThyloLin-Sca-1+
• CD4 és Mac-1 alapján 3 populáció különíthető el, és csak a Lin-Mac-1-CD4- populáció tartalmaz
nagyszámú tartósan újraképződő hemopoetikus őssejtet
• c-kit+Sca-1+ThyloFlk-2: hosszú távú repopulációs képesség
• c-kit+Sca-1+ThyloFlk-2+: rövid távú repopulációs képesség
• c-kit+ThyloLin-(Flk-2-) Sca-1+: egérben hosszú távú repopulációs képesség
Hemopoetikus őssejtek (HSC) II.
• Humán mintákban a CD34 antigén (funkciója nem ismert) expresszálódik
• További markerek: CD38, CDE90 ésCD133
• Thy+CD34+ hosszú távú kultúrák mieloid és limfoid sejtvonalakat egyaránt generálnak
• Thy-CD34+ nincsenek mieloid és limfoid
sejtvonalakat egyaránt generáló hosszú távú kultúrák
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Hemopoetikus őssejtek (HSC) III.
Humán hemopoézis Multipotens hemopoetikus őssejt (Hemocitoblaszt)
Mieloblaszt Közös mieloid
progenitor
Közös limfoid progenitor
Megakarioblaszt
Promegakarioblaszt
Megakariocita
Trombociták
Proeritroblaszt (Pronormblaszt)
Basofil eritroblaszt
Polikromatikus eritroblaszt
Ortokromatikus eritroblaszt (Normoblaszt)
Polikromatikus eritrocita (Retikulocita)
Eritrocita
Hízósejt Limfoid
dendritikus sejt Mieloid
dendritikus sejt Plazmasejt Makrofág
Kis limfocita
Természetes ölősejt T limfocita B limfocita
Prolimfocita Limfoblaszt
B. promielocita
B. mielocita
B. metamielocita
B. band
Basofil
N. promielocita
N. mielocita
N. metamielocita
N. band
Neutrofil
E. promielocita
E. mielocita
E. metamielocita
E. band
Eozinofil
Monoblaszt
Promonocita
Monocita
Mezenchimális őssejtek (MSC) I.
• Nincsenek hemopoetikus markereik (CD2, CD3, CD4, CD8, Mac-1/CD11b, CD14, CD15, CD19, CD20, B220, CD45, Thy1 és mieloperoxidáz)
• Expresszió: LDL receptor, alkalikus foszfatáz,
simaizom aktin, IV-es típusú kollagén, laminin, VII- es faktor, MUC18, CD29, CD44, CD49A-F, CD51, CD73, CD105, CD106, CD166+
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Mezenchimális őssejtek (MSC) II.
• MSC-k csontvelőből közvetlenül izolálhatóak NGFR (CD271), SSEA-1, SSEA-4, CD140b , CD340
(HER-2), CD349 (Frizzled-9) expresszió alapján
• Tisztítás: CD29+, CD44+, CD73+, CD105+, CD106+, CD166+, valamint a hemopoetikus receptorok
hiánya alapján
Endotél progenitor sejtek (EPC)
• Felnőtt EPC-k CD34+ vagy Flk-1+ (VEFR-2)
• További markereik: CD31, Tie2 és E-szelektin, eNOS, LDLR, VEGFR-1,-2,
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Csontvelői progenitor sejtek
• HSC és EPC sejtvonalak hasonló temporális és spatiális fejlődést követnek
• HSC és EPC közös markerei: VEGFR-2 (Flk-1), SCL/Tal1, Runx1
• Hemangioblaszt fenntartása
Periciták SMC
EC
Szövetvonalak ontogenezise a csontvelőben
HSC Oszteoblasztok MSC EPC
Stróma sejtek
Limfoid progenitorok
Mieloid
progenitorok Monociták
T-sejtvonal B-sejtvonal
Mezo-Angioblaszt Hemangioblaszt
(Flk-1+, VEcadherin+, CD45-)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A csontvelői őssejtek funkcionális egymásrautaltsága
HSC
MSC EPC
Mátrix proteinek,
adhéziós molekulák, citokinek sorát
expresszálja
