a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen
Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
ŐSSEJTEK (2)
a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen
Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Dr. Pongrácz Judit
Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue
engineering” – 3. Előadás
Köldökzsinórvér-őssejtek (CBE)
• Kb. 130 millió gyermek születik évente – a
regeneratív gyógyászat számára a köldökzsinórvér jelenti a legnagyobb potenciális őssejt-forrást
• Az elmúlt 36 évben több, mint 10000 beteget kezeltek köldökzsinórvér-őssejtekkel
• Több, mint 80 különböző betegség kezelésére
alkalmaztak köldökzsinórvér eredetű őssejteket
Köldökzsinórvér-őssejtek és magzati őssejtek
Köldökzsinórvér gyűjtése (Születés után)
A köldökzsinórvér sejteket speciális zsákban vagy kapszulában fagyasztják le
Folyékony nitrogén tartály (-150°)
A vér vizsgálata Sejt szeparáció
Keverés és ülepítés
Sejtek
koncentrálása Sejtek fagyasztása 35 perc 10 perc
Köldökzsinórvér hozzáadása
1 2 3
Krioprezerváció (Mélyfagyasztás)
• A primer sejtek krioprezervációja hosszú távon lehetséges (akár 20 évig)
• Az alacsony hőmérsékletet (-150-196 o C) folyékony
nitrogén biztosítja
Köldökzsinórvér feldolgozása
1. Vörösvértestek eltávolítása (Ficoll, Hetastarch, Lymphoprep, Prepacyte)
2. A kisebb tárolási méret érdekében a plazma eltávolítása
3. A kinyert sejtek tesztelése (fertőzés, térfogat,
cellularitás, őssejt-szám, CD34 + )
Köldökzsinórvér feldolgozása és krioprezerváció
• A köldökzsinórvér elsősorban hematológiai betegségek kezelésében hasznos
• A köldökzsinórvért születéskor gyűjtik
• Azonnal feldolgozzák vagy tisztítás nélkül DMSO
hozzáadásával folyékony nitrogénben lefagyasztják
Köldökzsinórvér bank
• Ideális esetben valamennyi nagyvárosban rendelkezésre áll, egy nemzetközi adatbázis-
hálózathoz csatlakozik, ahol valamennyi tárolt sejt HLA-tipizálásának adatai hozzáférhetőek.
• A köldökzsinórvér hosszú távú tárolása költséges
A köldökzsinórvér-őssejtek pluripotenciája
Köldökzsinórvér
Őssejtek
CBE MSC
Tisztítás
Endodermális Mezodermális Ektodermális
Hepatobiliáris Vér Neurális
Őssejtpopuláció a köldökzsinórvérben
Adherens Pre-MSC MSC
Nem adherens
CBE
Lin - CD133 + CD34 +
Köldökzsinórvér
Csontvelő
Perifériás vér
Köldökzsinórvér-őssejtekkel gyógyítható betegségek I.
Onkológiai betegségek
Akut limfoid leukémia Akut mieloid leukémia
Autoimmun limfoproliferatív betegségek Burkitt limfóma
Krónikus mieloid leukémia Monoszómia okozta citopénia Familiáris hisztiocitózis
Hodgkin-kór
Juvenilis mielomonocitás leukémia Langerhans sejtes hisztiocitózis Mielodiszpláziás szindrómák Non-Hodgkin limfóma
Immundeficienciák
Ataxia telangiektázia Porc-haj hipoplázia
Krónikus granulomatózus betegség DiGeorge szindróma
Hipogammaglobulinémia IKK gamma deficiencia
Autoimmun poliendokrin szindróma II-es típusú mukolipidózis
Myelokathexis
Súlyos kombinált immunhiányos betegség Wiscott-Aldrich szindróma
X-hez kötött agammaglobulinémia,
immunhiány, limfoproliferatív szindróma
Köldökzsinórvér-őssejtekkel gyógyítható betegségek II.
Hematológiai betegségek
Autoimmun neutropénia Ciklikus neutropénia
Diamond Blackfran anémia Evan szindróma
Vörösvértest aplázia Refrakter anémia
Súlyos aplasztikus anémia Sarlósejtes anémia
Thalasszémia Fanconi anémia Glanzmann-kór
Kongenitális szideroblasztos anémia
Juvenilis dermatomiozitisz és xanthogranulomák, stb.
Anyagcsere betegségek
Adrenoleukodisztrófia Alfa mannozidózis I-es típusú diabétesz Gaucher-kór
Gunther -kór
Hermansky-Pudlak szindróma Hurler szindróma
Hurler-Scheie szindróma Krabbe-kór
Maroteau-lamy szindróma Metakromatikus leukodisztrófia II-es és III-as típusú mukolipidózis
A és B típusú Neimann Pick szindróma Sandoff szindróma
Sanfilippo szindróma
Tay Sachs betegség
Zsírszövet-eredetű őssejtek (ASC)
Zsírszövet-eredetű őssejtek (ASC):
• Könnyen izolálható
• Állandó immunfenotípus jellemzi
• A csontvelői őssejtekhez (BMSC) hasonló
• Multipotens
• Genetikailag módosítható
A zsírszövetek típusai
Típus Funkció
1 Csontvelői zsírszövet Azon terek kitöltése, amelyek a hemopoézisben már nem vesznek részt
2 Barna zsírszövet (BAT) Az újszülöttek létfontosságú szerveinek védelme 3 Ektópiás zsírszövet Abnormális zsír felhalmozódás a májban, a szív- és
vázizomzatban (pl.: metabolikus szindrómában) 4 Emlő zsírszövete Szoptatás – energia és tápanyagforrás
5 Mechanikai zsírszövet Mechanikai traumától való védelem
6 Fehér zsírszövet (WAT) Hőszigetelés, energia raktározás, rezervoár,
endokrin szerv
Zsírszöveti őssejtek izolálása
Emésztés kollagenázzal 37 o C-on, 1 óra
Stróma-vaszkuláris frakció (SVF) Mosás PBS-ben
Zsírsejtek leszívása
300g, 5 perc
A zsír eredetű őssejtek immunfenotípusa Pozitív markerek
Marker Név Marker Név
CD9 Tetraspan CD55 Decay accelerating factor
CD10 Közös akut limfoid leukémia
antigén CD59 Protektin
CD13 Aminopeptidáz CD71 Transzferrin
CD29 b1-integrin CD73 5’-ektonukleotidáz
CD34 Szialomucin CD90 Thy1
CD44 Hialuronsav receptor CD105 Endoglin
CD49d a4-integrin CD146 Muc-18
CD54 Intracelluláris adhéziós
molekula CD166 Aktivált leukocita sejtadhéziós molekula
HLA-ABC Hisztokompatibilitási lókusz
antigén-ABC a-SMA a-simaizom aktin
A zsír eredetű őssejtek immunfenotípusa Negatív markerek
Marker Név Marker Név
CD11b ab-integrin CD50 Intracelluláris adhéziós
molekula-3
CD14 LPS receptor CD56 Idegsejt adhéziós molekula
CD16 Fc receptor CD62 E-szelektin
CD18 b2-integrin CD104 B4-integrin
CD45 Közös leukocita antigén HLA-DR Hisztokompatibilitási lókusz
antigén-DR
A zsírszövet eredetű őssejtek citokinprofilja
CITOKIN FUNKCIÓ
• Adiponektin
• Leptin
• Plazminogén aktivált inhibitor-1
Adipokinek
• Hepatocita növekedési faktor
• Pigment epitél eredetű faktor
• Vaszkuláris endoteliális növekedési faktor
Angiogén
• Flt-3 ligand
• GCSF
• Leukémia inhibitor faktor
• IL-7
• MCSF
Hemopoetikus
• IL-6, IL-8, IL-11
• Leukémia inhibitor faktor
• TNFa Pro-inflammatorikus
A zsírszövet eredetű őssejtek immunogenitása
• Az immunogenitás hiánya annak köszönhető, hogy a felszínükről hiányoznak a II-es típusú fő
hisztokompatibilitási antigének (HLA-DR).
• Immunszuppresszív tulajdonságuk a prosztaglandin
E2 termeléshez kapcsolódik.
A zsírszövet eredetű őssejtek differenciáciálódási potenciálja
• Zsírsejt
• Szívizomsejtek
• Porcsejtek
• Endodermális és ektodermális sejtvonalak
• Endotél és simaizom sejtek
• Hemopoetikus sejtek
• Neuronális sejtvonal
• Oszteoblasztok
• Harántcsíkolt izomsejtek
Zsírsejtekké történő differenciáció
A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS Fehér zsírszövet Forskolin (AMP agonista) Neutrális zsírok Funkcionális zsírpárnák
Methylisobutylxanthine
(AMP agonista) Adiponektin Plasztikai sebészet Glükokortikoid receptor
ligandok (dexamethasone)
CAAT/enhancer kötő protein-a zsírsav-kötő fehérje (aP2)
Kozmetikai és helyreállító sebészet
PPAR-g2 ligandok
(thiazolidinedione) Leptin
Inzulin Lipoprotein lipáz
bFGF PPAR-g2
Szívizomsejtekké történő differenciáció
A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS Barna zsírszövet 5-azacytadine Szarkomer aktinin Ischaemiás károsodás után
a sérült szívizomszövet helyreállítása
Fehér zsírszövet Szívizomsejt kivonat Konnexin-43
Dezmin
troponin-I
Porcsejtekké történő differenciáció
A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS Csontvelői zsírszövet Aszkorbinsav Aggrecan Térd, csípő porcszövet Barna zsírszövet Dexamethasone Kondroitin-szulfát
Fehér zsírszövet TGF-b II-es típusú kollagén
3D struktúra IV-es típusú kollagén
BMP-6 Porcsejt-specifikus
proteoglikánok
FGF
Oszteocitákká történő differenciáció
A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS
Fehér zsírszövet Aszkorbinsav Oszteokalcin Csont implantáció
Csontvelői zsírszövet Dexamethasone DMP-1 Csonttörés helyreállítása 1,25-dihidroxi-
kolekalciferol Oszteoadherin B-glicerolfoszfát
BMP-2
BMP-7
Runx2
Harántcsíkolt izomsejtekké történő differentáció
A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS FBS alacsony
koncentrációja myoD
Ló szérum Miogenin
Miozin könnyűlánc kináz
Idegsejtekké történő diferenciáció
A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS Indomethacin Gliális fibrilláris savas
fehérje (GFAP) Központi idegrendszer sérülései
Inzulin Nestin
Metlizobutilxantin Intermedier filamentum Glutamát receptor
alegységek S-100
B-III tubulin
Differenciáció endodermális és ektodermális sejtvonalakká
A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS Csontvelői zsírszövet Hepatocita növekedési
faktor Albumin Máj
Oncostatin M A-fetoprotein DMSO és HGF, bFGF,
nicotinamid együtt Urea
ATRA Citokeratin-18 Epitél szövet helyreállítás
(Crohn-betegség)
Endotél és simaizom sejtekké történő differenciáció
A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS
Fehér zsírszövet CD31 Vaszkuláris trauma
kalponin Urogenitális trauma
a-simaizom aktin
Hemopoetikus utánpótlás
A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS ASC-k szekretálják:
IL6,IL7, IL8, IL11, SCF, TNFa, MCSF, GMCSF
CD34
+a T, NK sejteken, B- sejt markerek
Nagydózisú kemoterápiát
követő hemopoetikus
őssejt-helyreállítás
ŐSSEJTEK (3)
a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen
Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Dr. Pongrácz Judit
Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue
engineering” – 4. Előadás
ESC-k és ASC-k felhasználása
Érlumen
Vaszkulogén zóna Keringési betegségek
Génterápiák
Genetikailag módosított őssejtek Intravénás
injekción
Mesoderma
Szívbetegségek CSCs
Pitvar niche Szívcsúcs niche
HSC
EPC MSC
Oszteoblasztok Porcsejtek
Zsírsejtek Mioblasztok Közös limfoid
prekurzor NK-sejtek T-limfociták Dendritikus sejtek B-limfociták Közös mieloid
prekurzor
Makrofágok Vérlemezkék
Eritrociták Monociták Granulociták HSCs
Endoszteum felszín niche Hajszálér hálózat niche
MSCs
Perivaszkuláris felszín niche
Csont
Hemopoetikus és Immun- rendszeri megbetegedések
Endoderma
BASCs BADJ niche
Tüdőbetegségek
PSCs Hasnyálmirigy- vezeték
feltételezett niche
Hasnyálmirigy
Inzulin-termelő b-sejtek
Endokrin Langerhans szigetek
Exockrin acinusok
Cukorbetegség Máj
Májsejtek
HDCs Epevezeték (Hering csatorna) Májbetegségek
Tüdő
Ektoderma
NSCs
Szubventrikuláris zóna niche
Hippokampusz niche (gyrus dentalis ) Neuron Asztrocita Oligodendrocita
Agyi és gerincvelői rendellenességek
Szembetegségek RSCs
Csillós epitél niche
CESCs Limbus niche Retina
Cornea
KSCs
Alapréteg niche bESCs eNCSCs
„Bulge” régió niche SKPs
Tüsző papilla Bőrbetegségek
Szív
Szívizomsejtek
Embrionális fejlődés
Belső sejttömeg ESC Blasztociszta
Pluripotens ESC
Mezodermális őssejt Endodermális
őssejt
Ektodermális őssejt Hemangioblaszt
HSC EPC
Érfalban található őssejtek EPCs and MSCs Új endotélsejt
Véráram Makrofág
Vérlemezke
Eritrocita Monocita
Eozinofil
NK-sejt T-limfocita Dendritikus sejt B-limfocita Bazofil
Neutrofil
Media
Agy
Szem
Bőr
Génsebészet és génátvitel ASC-k felhasználásával
• ASC sejtek transzdukciója lentivirális vektorokkal
• Egyéb rekombináns virális vektorok
• Nukleofekció
Az őssejt-szaporodás és differenciáció irányítására alkalmazott módszerek
A többféle méretben és típusban kapható bioreaktorok növelik a tápanyagok illetve bomlástermékek cseréjének hatékonyságát, elősegítik a növekedési faktorok transzportját, lehetővé téve a sejtkultúrák hosszú távú fenntartását, és így nagyobb sejtszám vagy nagyobb szövetméret elérését.
A „scaffold”-ok fizikai (pl.: felszíni érdesség, porozitás, stb.) és biokémiai (pl.: beágyazott növekedési faktorok szabályozott felszabadulása) sajátságai elősegítik a sejtek
tapadását, toborzását,
differenciálódását, illetve megkönnyíti a sejtek szállítását.
A kívánt sejtekkel vagy szövetekkel (pl.: szövetregeneráció céljára) létrehozott ko-kultúrák a közvetlen fizikai kontaktus és/vagy közvetett biokémiai jelek útján elősegíthetik a differenciációt.
A tenyésztőmédiumhoz adott különböző biokémiai faktorok (szérumot beleértve) stimulálják a differenciációt. Ehhez szükséges azon faktorok ismerete, amelyek valószínűleg elősegítik a differenciációt, ugyanakkor ritka a 100%-os hatékonyság.
Egyes specifikus sejttípusok szelekciója adhéziós assay-el specifikus ECM fehérjék vagy receptor ligandok felhasználásával a sejt- szubsztrát interakciók affinitása és kinetikája alapján. Ide tartozik a kolónia formáló egység (CFU) assay is.
Sejt-szortoló technikák alkalmazásával (MACS vagy FACS) a kívánt sejtek kiválogathatóak (vagy a nem kívánt sejtek eltávolíthatóak) sejtfelszíni antigéneket kötő antitestek felhasználásával vagy fluoreszcens markerek, például GFP expresszió alapján.
FACS MACS
Sejtvonal-specifikus génekkel történő transzdukció segítheti a differenciáció irányítását. Riporterek (pl.: GFP) alkalmazása megkönnyíti a sejtek szelekcióját (pl.: FACS) illetve a génaktiváció helyének és idejének ellenőrzését.
Gén
Riporter (pl. GFP)
Újraprogramozás
Vírus szállítja az újraprogramozáshoz szükséges faktorokat a szomatikus sejt magjába
Pluripotens iPSC sejtvonal
Tenyésztés hESC-ként Szomatikus sejt
újraprogramozása
Sejtek differenciálódása I.
Prekurzor sejt
Szabályozó fehérje 2
Szabályozó fehérje 3
Szabályozó fehérje 1
Sejt A Sejt B Sejt C Sejt D Sejt E Sejt F Sejt G Sejt H
Szabályozó fehérje 3
Szabályozó fehérje 3 Szabályozó
fehérje 3
Szabályozó fehérje 2
Sejtosztódás
Sejtek differenciálódása II.
Blasztociszta Zigóta
Gasztrula
Ivarsejtek
Spermium Petesejt
Mezoderma (Középső réteg)
Simaizom Szívizom Harántcsíkolt
izomsejtek Vörösvértestek Vesetubulus
sejtek
Endoderma (Belső réteg)
Tüdősejt
(Alveroláris sejt) Pajzsmirigy
sejt Hasnyálmirigy sejt
Ektoderma (Külső réteg)
Epidermisz
bőrsejtjei Agy neuronjai Pigmentsejt
