E N Z I M K I N E T I K A Dr László Elemér egyetemi tanár0

E N Z I M K I N E T I K A

Dr László Elemér egyetemi tanár

Budapesti Mûszaki Egyetem

Mezõgazdasági Kémiai Technológia Tanszék 1997/98

Bevezetés

Az enzimkinetika az általános kémiai reakciókinetika része, hiszen itt is kémiai reakciók lejátszódásáról van szó, csak ezek olyan katalizált

kémiai reakciók, amelyben a katalizátor eserepét fehérje alapú molekulák az enzimek töltik be. Az enzimkinetika alapjaival, alapösszefüggéseivel a Biomérnöki mûveletek I. tárgy keretében már megismerkedtek , ezért arra épitve, annak ismeretanyagát kibôvitve, egy részletesebb és mélyebb betekintést kiván nyujtani ez az enzimkinetika tárgy. Ennek megfelelôen az egyes fejezetek elôtt mindig hivatkozás történik azokra az ismeretanyagokra, amelyeket tudottnak tételezhetünk fel és amelyekbôl kiindulva az új anyag érthetôvé válik. A tárgyalásra kerülô tananyag az alábbi fejezetekre tagolódik: 1.

Egy enzimes egy szubsztrátos reakciók kinetikája.

1.1. Rapid equilibrium, vagy steady state.

1.2. Egyedi módszerek a Km és Vm meghatározására.

1.3. Valószinûségi és molekuláris enzimkinetika.

1.4. Enzimgátlás kinetikája.

1.5. Enzimaktiválás kinetikája.

2. Egy enzimes több szubsztrátos reakciók kinetikája.

2.1. Látszólagosan egy szubsztrátos reakciók.

2.2. Két szubsztrátos reakciók kinetikája.

2.3. Három szubsztrátos reakciók kinetikája.

3. Több enzimes egy szubsztrátos reakciók.

4. Több enzimes több szubsztrátos reakciók kinetikája.

Nem foglalkozik a jegyzet a transzport-folyamatok , az anyagcsere

folyamatok kinetikájá-val , az enzimszintézis kinetikájával és az enzimes - oldott, vagy rögzitett enzimeket használó - reaktorok kinetikájával.

1. Egy szubsztrátos egy enzimes reakciók kinetikája.

Az egyszerû, egyszubsztrátos enzimes reakciók determinisztikus leirására- mint a BIM I.-ben megismerték- az ES-komplex képzôdés gyors egyensúly beállására ( rapid equilibrium ) épülô Michaelis-Menten kinetika(1.1) ,ill. az ES-komplex állandósult állapotát ( steady state )

feltételezô Briggs-Haldane kinetika(1.2) szolgál. A megfelelô kezdeti sebesség egyenletek :

v V S

K S

m 0  S



* ill. ^v _K^{Vm S}_S

0  m



* (1.1)

Mindkét egyenlet egy derékszögû hiperbolát ir le , de a nevezôkben szereplô állandók

( Ks és Km ) jelentése nem azonos , mivel

K k

S k^1

1 , ill. ^Km ^k_1k^k₂

1 (1.2)

A Ks tehát egy egyszerû ES-komplex disszociációs állandó , a Km pedig magába foglalja a k2 termékkképzési állandót is. Mikor

melyik kinetikával irható le egy adott enzimes reakció ?

Ehhez ismerni kellene az egyes sebességi állandókat, mert ha a k2 termékképzési sebességi állandó olyan kicsi, hogy csak elhanyagolható változást okoz a konstans tört értékében , akkor Ks ~ Km-mel , vagyis a klasszikus Michaelis-Menten kinetikai egyenlet használható. A sebességi állandók közül a k2 könnyen meghatározható, mivel

Vm= k2 * [ E ] (1.3)

és a Vm az ismert grafikus módszerekkel ( lásd Lineweaver-Burk, Hanes, Eadie- Hofstee , stb. módszereket ) meghatározható , az

enzimkoncentráció ma már a legtöbb esetben mólkoncentrációban kifejezhetô ( a legtöbb enzim móltömege ismert ) , igy a termékképzési

állandó számolható. Azonban a k-1 és a k1 egyedi meghatározására csak kivételes esetekben van lehetôség ( ezeket késôbb tárgyaljuk ) , tehát a fenti kérdés eldöntésére más útakat kell választani.

1.1. Rapid equilibrium , vagy steady state . A kérdés eldöntésére felhasználható módszereket aszerint

csoportosithatjuk, hogy milyen mérési módszer áll rendelkezésünkre, pontosabban milyen változó mérését teszi lehetôvé az adott ES-komplex képzôdése.

1.1.1. Kinetikai módszerek

1.1.1.1 ES-képződés mérésén alapuló módszerek:

Ha leginkább az optikai módszerek( fényelnyelés, fluoreszcencia, ennek polarizációja, optikai forgatóképesség, fényszórás, stb.)

valamelyikével mérni tudjuk az [ES]-t , a kötött, vagy a szabad [S]-t ( [Sb] , ill. [Sf] ), akkora linearizált sebességi egyenletek az alábbi módon alakithatók át a Ks meghatározására ( bármelyiket tudjuk mérni, akkor már mindhárom ismert mivel) :

[ ES ] = [ Sb ] és [ ST] = [ Sb] + [ Sf] . A Lineweaver- Burk egyenlet (11.1) :

1 1 1 1

0 2 2 2 2

v k S

K S

k E S

K

k E S k E

b

S f

T f

S

T f T

  

 

* * * (11.1)

ebbôlaz u.n. Klotz egyenlet (11.2):

1 1 1

S

K

E S E

b

S

T f T

 *  (11.2)

Abban az esetben ha egy enzimmolekulán 1-nél több, n szubsztrát kötôhely található ( errôl késôbb a dimer, trimer, tetramer enzimeknél beszélünk ) akkor

1 1 1

S

K

n E S n E

b

S

T f T

 *  (11.3)

ill. [ET]-vel átszorozva:

E S

T b

K n

S* 1 1

S_f n (11.4)

ha n = 1, akkor 1 kötôhely van Ábrázolva (11.1.ábra):

0 2 4

-2 0 2

1 [Sf]

[ E ] [ Sb]

11.1.ábra . KS meghatározása Klotz szerint.

Az ordináta tengelymetszet : 1/n Az abszcissza " " : - 1/ Ks Az Eadie-Hofstee egyenlet (11.3,11.4):

vo= - Ks ^v_S^{0 Vm} (11.5)

k2 [Sb] =^{KSk S}_S ^{b k E}

f T

2 2 (11.6)

k2-vel, [ET]-vel, majd Ks-sel osztva S

S E

b f T

  1 K E S

S T b n

K_S ( Scatchard egyenlet,11.5 ) (11.7) Ábrázolva (11.2.ábra):

0 1 2 3 4

0 1 2 3 4

[Sb]

[Sb]

[E][Sf}

11.2.ábra

KS meghatározása Scatchard ábrázolással.

Ordináta metszet: n/ Ks Abszcissza " : n*[ ET]

A Hanes egyenlet (11.6).:

^S v₀  1

V S

m K V

S

m (11.8)

S k S

f 2 b

 1

k2 n E S

T f

* + Ks /k2*n*[ET] (11.9)

S S

f b

 1 n E S

T f  K n E

S

T (11.10)

Ábrázolva (11.3.ábra):

0 1 2 3 4

-2 0 [Sf]2

[Sf][Sb]

11.3.ábra

KS meghatározása a Hanes egyenlettel.

Abszcissza metszet : - Ks

Ordináta " : Ks/(n*[ET]) Iránytangens : 1/(n*[ET])

Ha az optikai módszerekkel ( l. fennt) nem tudunk tényleges

koncentrációkat mérni, de bizonyos arányokat meghatározhatunk, akkor az alábbiak szerint járhatunk el.

Mérni tudjuk az ES-komplex képzôdésének fényabszorbancia változását (A, 11.4.ábra) és a szokásos módon meg tudjuk határozni a teljes szubsztrát telitésnél a maximális fényabszorbancia változást (^A max , 11.5.ábra) . A telitési görbe egyenlete ebben az esetben :

 

A A S

K_S S

 

max és ¹

A  K A

 _maxS * 1

S  1

A_max (11.11) Ábrázolva megkaphatjuk a maximális abszorbancia értékét :

[S]

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

0 1 2 3 4

A

11.4.ábra

Az enzim abszorbanciájának változása [S] függvényében .

1/[S]

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

-2 0 2

1 A

11.5.ábra

A maximális abszorbancia meghatározása.

Az ordináta-metszet az 1/A max értéket adja, mig az iránytangensbôl a Ksnyerhetô. De a Ks a Michaelis egyenletbôl is megkapható :

   

  ^{ }

S v K

V v

k ES K k E k ES

S m

S T

  



0 0

2

2 2

(11.12

S ES

K E ES

S T

  

S A

A E

K

E A

A E

T

S

T T







max  max



 (11.13)

A különbözô szubsztrát-koncentrációknál mért értékekbôl szerkesztett diagram iránytangense adja a Ks értékét.

Más esetben mérni tudjuk a megkötött szubsztrát molekulák relativ értékét ( az m=Sb/ ST értéket, amely 0 és 1 között változhat ) :

A megfelelô disszociációs állandó :

K E S

S fESf 

 

   

 

 

E ES S ES

ES

T  T  =

        ^{ }  

 

S S E S

S

T b T b

b

 

(11.14)

[ST]-vel osztva és n kötôhelyet feltételezve:

 

 

K

 

S  m

  

 



1 m n E S ^T m

T

* és (11.15)

 

 

1

 

1

1 1

  

m

n E

K m S K

T

S T S

(11.16) Ábrázolva (11.6.ábra):

-1 0 1 2 3

0 2 4

1 1-m

1 m[ST]

11.6.ábra

KS meghatározása a kötött szubsztrát relativ értékeibôl.

Ordináta-metszet: - 1/ Ks

Abszcissza-metszet: 1/(n*[ET]) Iránytangens: n*[ET] / Ks .

Ismét más esetben meg tudjuk határozni az ES-komplexek relativ értékét

( R= ES/ET):

   

     ^{ }     ^{ } 

K E S

 

ES

E ES S ES

S ES

f f T T

 *   * 

(11.17 [ET]-val osztva:

 

 

K

R S

E R

S R

T

 T

  









1 *  (11.18)

Átrendezve és n kötôhelyre vonatkoztatva:

1 1

1 1

  

R n K E S

R K

S T

T

* * * S (11.19)

Ábrázolva (11.7.ábra):

-1 0 1 2 3

0 2 [ST]4

R 11.7. ábra

KS meghatározása az ES komplexek relativ értékeibôl.

Ordináta-metszet : - 1/ Ks

Abszcissza-metszet : n*Ks*[ET]

Ha a fenti módszerek bármelyikével kapott Ks érték megegyezik a szubsztrát-

koncentráció változtatásával meghatározott Km értékével ( lásd Lineweaver- Burk,

Eadie-Hofstee, Hanes módszereket ) akkor a klasszikus Michaelis-Menten (rapid

equilibrium) mechanizmussal van dolgunk ( azaz Ks= k-1/ k1 ), ellenkezô esetben a

Brigss-Haldane kinetikával állunk szemben (steady state ).

1.1.1.2. Szubsztrát védôhatása az enzim inaktiválódásánál .

A szubsztrátok védôhatást fejthetnek ki különbözô fizikai ( pl. hôdenaturáció ), kémiai ( pl. fehérjereagensek, savak , stb. hatására) és enzimes

( pl.proteolizis) inaktiválódás ellen. A módszer szélesebb körben

alkalmazható, mint az eddigiek, de csak akkor, ha az inaktiválódás sebessége eltérô a szabad enzim, ill. az ES-komplex esetében. Az inaktiválódás

sebességét

a szokásos enzimaktivitás mérési módszerekkel követhetjük.

Az enzim inaktiválódásakor két eset fordulhat elô : Csak a szabad enzim károsodik , vagyis a szubsztrát teljes védelmet biztosit az inaktiváló-

dás ellen :

E + S KS ES Ei

Az inaktiválódás általában látszólagos elsô rend szerint játszódik le. Legyen a különbözô szubsztrát-koncentrációknál mért denaturációs sebességi állandó kd ,a tényleges denaturá-

ciós sebességi állandó kdo ( amit külön kisérletben szubsztrát távollétében meg is mérhetünk , de ebben az esetben grafikusan is megkaphatunk). Mivel a szubsztrát védôhatása azáltal jön létre, hogy komplexbe viszi az enzimet , vagyis a védôhatás a telitési görbé reciprokával

irható le,

[S]

0 0.2 0.4 0.6 0.8

0 1 2 3 4

[S]

0 0.5 1

0 2 4

[Ef]

11.8. ábra : Szubsztrát telitési görbe, ill. a szabad enzim [S] függése.

Ha a szubsztrát távollétében mért denaturáció sebessége vdo és az egyes szubsztrát-koncentrációknál mért denaturáció sebessége pedig vd, akkor a szubsztrát védôhatása a

fentiek szerint (11.9.ábra):

[S]

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0 2 4

vd vd0

vd

11.9.ábra: A szubsztrát védôhatása Vagyis a védôhatás sebességi egyenlete:

    

     

 

 

v v v S

K S v S

K S v K S S

K S

v K

K S

d do

do s

do

s

do s

s

do s s

 

  





 

   





 

 

 



 



1

(11.20)

A sebességi állandókkal leirt összefüggés pedig:

k k K 

K S

d do

s s

 



 

, reciproka pedig ^{1 1 1}

k k K S

d do s kdo

 

* * (11.21)

Ábrázolva (11.10.ábra):

[S]

0 1 2 3 4

-2 -1 0 1 2

1 kd

11.10. ábra : KS meghatározása szubsztrát védôhatásnál.

Iránytangens : 1/(kdo*Ks) Abszcissza metszet : - Ks Ordináta metszet : 1/ kdo

A második esetben a szabad enzim és a komplex egyaránt károsodik, de eltérô sebességgel ( mert azonos sebességnél nincs védôhatás ) :

E + S ES

Ei kdE

Ks

kdES Ei

A mért együttes denaturációs sebességi állandó kd , szubsztrát nélkül megmérhetô a szabad enzim denaturációs sebességi állandója kdE , az ES- komplex denaturációs sebességi állandója kdES . A denaturáció eredô sebessége a két hatás összege. De a szubsztrát-koncentráció az elsô esetben csökkenti, a második esetben növeli a denaturáció sebességét (11.11.ábra):

[S]

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0 1 2 3 4

vd

vdE vdoEvdES

11.11.ábra : Denaturációs sebességek [S] függése.

Igy a mért denaturációs sebesség is a két egyedi sebesség összege:

    

 

 

v v v v v S  

K S

v S

K S v v v S

K S

d dE dES doE

doE s

dES

s doE

dES doE

s

   

 

   



* *

(11.22)

   

v v v v  S

K S

d doE

dES doE

s

  

 (11.23)

Ugyanez sebességi állandókkal és reciprokot képezve:



 







s

dES doE dES doE

 

 

*  (11.24)

Ábrázolva (11.12.ábra):

1/ [S]

0 1 2 3 4

-2 -1 0 1 2

1 kd- kdE

11.12. ábra : KS meghatározása szubsztrát részleges védôhatásánál.

Abszcissza metszet : - 1/ Ks

Ordináta metszet : 1/ (kdES- kdoE)

Ezekbôl Ks és kdES meghatározható , de egyéb ábrázolási mód is létezik.

1.1.1.3. Enziminhibitorok védôhatása :

A módszer csak akkor alkalmazható a Ks meghatározására , ha az ismert módszerekkel mért Ks , vagy Km egyenlô a Ki -vel , vagyis amikor szubsztrát-analógot használunk inhibitorként . Ilyenkor is károsodhat mind a szabad enzim, mind pedig az enzim-inhibitor ( EI ) komplexben lévô enzim. A szabad enzim és az EI komplex koncentrációja függ az inhibitor koncentrációjától (11.13.ábra):

^{[ I ]}

0 0.2 0.4 0.6 0.8

0 2 4

[EI]

11.13. ábra : Az [EI] függése az [I]-tól.

A mért denaturációs sebesség itt is a két sebesség összege : vd = vdoE + vdEI

A fentiekhez hasonló levezetéssel:



 







s

dES doE dES doE

 

 

 (11.25)

Különbözô inhibitor-koncentrációknál mért denaturációs sebességi állandók ábrázolásá-

val a Ks=Ki és kdES=kdEI meghatározható (11.14.ábra):

1/ [I]

0 1 2 3 4

-2 -1 0 1 2

1 kd- kdoE

11.14. ábra : KS meghatározása inhibitor védôhatása esetén.

Abszcissza metszet : - 1/ Ks=-1/Ki

Ordináta " : 1/ (kdES - kdoE)=1/(kdEI-kdoE)

1.1.1.4. Egyensúlyi dializis :

Ha van olyan szubsztrát-analóg , amelynél Ks = Ki , akkor dializáló hártyával elválasztott két térfél közül abban amelyikben a vizsgált enzim található a komplex-

képzés miatt a szubsztrát-analóg az egyensúly beállása után feldúsul ([ESa

]+[Sa1]), mivel a dializáló hártya csak a szubsztrát-analóg számára átjárható.

[ET] [Sa]

[ESa]+ [Ef]

[Sa1] [Sa2]

A dúsulás mértéke, vagy a higulás mértéke mérhetô kémiai módszerekkel, de még egyszerübben izotóppal jelzett szubsztrát-analóg esetében.

Egyensúlyban :

[Ef] + [Saf] ^ [ ESa] és ^{KS E Sf}_ES ^af

a

 (11.26)

de : [ET] = [Ef] + [ESa]  [Ef]=[ET]-[ESa] A beadagolt szubsztrát-analóg megoszlása:

[Sa]=[ESa]+[Sa1]+[Sa2]  [ESa] = [Sa]- 2[Sa2] , mivel egyensúlyban: [Sa1]=[Sa2]

Behelyettesitve :

   

   

         

              

K E ES S

ES

E S 2 S

S 2 S S E S

S 2 S S

S

T a a2

a

T a a2

a a2

a2

T a2

a a2

  a2

  

 

  (11.26a) Igy a bemért enzimkoncentráció és szusztrát-analóg-koncentráció ismeretében, mérve a nem enzimes oldal szubsztrát-analóg

koncentrációt ( radioaktivitást) a KS számolható.

A levezetés csak azonos térfogatú két térfél esetén igaz, ha a térfogatok eltérôek úgy azt is figyelembe kell venni.

1.1.2. Egyedi sebességi állandók meghatározása.

Az egyedi sebességi állandók meghatározása még egyedibb módszereket igényel, mint az eddig tárgyaltak.

1.1.2.1. Slater módszer(11.7) : csak olyan esetekben alkalmazható, ha a k2 termékképzési sebességi állandót úgy tudjuk változtatni, hogy közben sem a k1 , sem a k-1 állandók nem változnak. Ezt egyes

dehidrogenázoknál a H-donor, ill. az akceptor változtatásával el lehet érni.

Ismert, hogy

K_mk k k

 

1 2 

1

k k

¹ 

1

k

k₁² = KS + ^k_k²

1

(11.27) a 2.tagot ET-vel szorozva :

Km = Ks + ^{k E}_{k E}^T

T 2

1 = Ks + Vm /k1*[ET] (11.28) Ha változtatjuk a k2 - ôt ( Vm-ot ), akkor ábrázolhatjuk a Km-et a Vm függvényében (11.15.ábra):

0 1 2 3 4

-2 0 2

Vm Km

11.15. ábra : Sebességi állandók meghatározása Slater módszerével.

Abszcissza metszet : k-1* [ ET]

Ordináta " : Ks ; igy k1 is megkapható.

1.1.2.2. Gutfreund - Roughton módszer(11.8,11.9) :

Akkor alkalmazható, ha rendelkezésre áll valamilyen gyorsreakció- mérô készülék, " stopped flow" (mûködési elve a 11.16.ábrán látható) ,vagy "quenched flow" (11.17.ábra) berendezés (részletesen lásd 11.10.irodalom).

motor enzim szubszt.

töltés töltés

keverô

küvetta

kapcsoló 11.16.ábra. A stopped flow berendezés elvi sémája.

motor enzim

szubszt.

töltés töltés

keverô kapilláris

leállitó oldat 11.17.ábra. A quenched flow berendezés elvi sémája.

Mindkét berendezés esetén közös az enzim és a szubsztrát-oldat

adagolására szolgáló két pumpa és ezek gyors összekeverésére szolgáló keverô kamra. Ezután a reakcióelegy a stopped flow esetén egy átfolyó küvettába , mig a quenched flow esetén egy változtatható hosszúságú kapillárisba kerül. Az áramlás leállitását az elsô esetben egy forditott állású fecskendô motort kikapcsoló hatása hozza létre, ami után elkezdôdhet a termékképzési görbe felvétele. A második esetben a

kapillárisból a reakcióelegy egy leállitó oldatba (pl. triklórecetsav oldatba ) kerül, amelybôl egy idôpontnak megfelelô termékképzés határozható csak meg. Egy teljes görbe felvételéhez tehát több kisérletet kell elvégezni. A fenti módszerekkel tehát mérhetjük a termékképzôdést a pre-steady state folyamán általában msec, egyes esetekben ^sec idôtartamban

(11.18.ábra). A gyors nyomonkövetés itt is általában optikai módszerekkel történhet.

t (msec) 0

10 20 30 40 50 60 70

0 2 4

[P]

11.18.ábra. Termékképzôdés a pre-steady state-ben.

A pre-steady state-ben játszódik le az ES-komplex képzôdése, itt nem érvényes a

d [ES]/ dt = 0 feltevés, hiszen éppen ez változik.

Mint ismeretes felirható : d ES

dt = k1*[E] *[S] - ( k-1+ k2) * [ES] =

= k1( [ET] - [ES] ) * [S] - ( k-1 + k2 ) * [ES]

megoldva :

[ES] = _{k S k}^{k E1 T S} _k

1  _1 2 ( 1 - e xp{- t ( k1*[S] + k-1 + k2)} ) (11.29) Az [ES] igy változik az idôben , ha [S] konstans. Ismert viszont,hogy

vo = k2* [ES] = ^{d P} igy dt

   

d P k ES dt

o t

P P

o







A baloldalt integrálva , a jobb oldalra behelyettesitve a 11.29. [ES] képletet és az exponenciális tagot sorbafejtve (a kis idôk miatt a magasabb tagokat elhanyagolva) kapjuk:

P  P_o k k₁* ₂* E_T * S t* /² 2 (11.31) Ebbôl a k1*k2 számolható.

Még két egyenletet ismerünk : Vm= k2* [ET] ; és ^Kmk k

k

₁ ₂

1

igy a három ismeretlen sebességi állandó már számolható.

Grafikusan is hozzájuthatunk a sebességi állandókhoz, ha a [P]--- t diagramból meghatározzuk a pre-steady state idejét , amely a vo kezdeti sebességnek megfelelô iránytangensû egyenes szakasz abszcissza

metszetét jelenti (11.19.ábra):

idô -2

-1 0 1 2 3 4 5 6

0 2 4

[P]

11.19.ábra. Kezdeti termékképzési diagram.

A pre-steady state idôtartama ( a 11.29. egyenlet 3 sebességi állandót tartalmazó nevezôje, ill. a 11.19. ábra abszcissza metszete ) :

1

 = --- (11.30) k1* [S]+k-1+ k2

Az egyenes ordináta-metszete legyen Pt , igy egyenlete:

P=- Pt+vo*t P=0-nál : Pt=vo*t=vo* ^

Behelyettesitve a ^ fentebb közölt értékét:

P v

k S k k

V S

K S k S k k

t o

m m

   

 

 

1 1

1 1 2 1 1 2

*

* * (11.31)

A nevezô osztva és szorozva k1-gyel:

 

_

_





P V S

K S

l k K S

V S k K S

t

m

m m

m m

   



* * *

1 1

2 (11.32)

Ha [S]>>Km , akkor vo= Vm és

P V

k S v

t m

l

  o

* * és ^{ } _k ^l _S

l* (11.32a)

Igy a k1 számolható, a k2 a Vm-ból, a k-1 pedig a Km-bôl megkapható.

A teljes görbe ( a pre-steady-state + a vo iránytangensû egyenes szakasz ) matematikai leirása:

az egyenes egyenlete: ^P ^vo*^{t P} t

az exponenciális szakasz egyenlete :  ^P 

 

a kettô együtt pedig :

 

 





1.1.2.3. Eigen relaxációs módszere(11.11).

Az eddigiekkel ellentétben ez a módszer reverzibilis enzimes reakciók esetében alkalmazható. Az iparilag jelenleg legfontosabb

reverzibilis enzimes reakció a glükóz izomerizációja glükóz-fruktóz eleggyé. A glükózizomeráz enzim jellemzése, nyilt gyûrüs

reakciómechanizmus ismertetése.

Mint ismert a reverzibilis reakció egyenlete:

k1 k2 k3

E + S ES EP E + P

k-1 k-2 k-3

Az eredô kezdeti sebesség az egyenletnek megfelelô irányban az elôre és a vissza irányú reakció sebességének különbsége :

   

   

   

v k ES k EP

V S P

K

K P

K S

os

ms

eq

ms

mp

  

 

 



 

 

 

2 2

1

*

(11.33)

Forditott irányban ugyanigy felirható az eredô kezdeti sebesség. A kétirányú kezdeti sebesség értékekbôl - amikor még elhanyagolható a termékkoncentráció - megkaphatók a Kms , Kmp , ill. Vms , Vmp értékek.

Az egyedi sebességi állandók viszont az egyensúlyt megzavaró , perturbáló hôfok, vagy nyomás hatására fellépô relaxáció idejébôl számolhatók

Ha az ES- ( vagy EP )- komplex perturbáció hatására fellépô relaxációs idejét ₁ -gyel , a termékképzôdés relaxációs idejét ₂ -vel jelöljük, akkor két esetet különböztethetünk meg :

ha ^{1 1}

1 2

   , akkor felirható a következô függvény ¹

   

1  f S_eq , E_eq

ábrázolva az 1/ ₁ értékeket különbözô [Seq] ill. [Eeq] értékekkel és extrapolálunk

[Seq] = 0 , ill. [ Eeq] = 0 értékekre, megkapjuk a k-1 és k2 értékeket. Km és Vm ismeretében az egyéb sebességi állandók is számolhatók.

Ha a fenti egyenlôtlenség nem áll fenn, akkor a ₁ és ^2 összegébôl és szorzatából határozhatók meg az egyedi sebességi állandók.

A fenti módszerekkel meghatározott egyedi sebességi állandók számértékei segitségével eldönthetô, hogy Ks = Km , vagy sem , de felhasználhatók az enzimes reakciók részreakcióinak

termodinamikai vizsgálatára is ( l. késôbb).

1.1.2.4. Sebességi állandók meghatározása polimerázoknál(11.12).

A polimeráz enzimek hatásmódjuk szerint két nagy csoportba sorolhatók:

endo-hatású polimeráz hidrolázok , amelyek a polimeráz lánc belsô kötéseit random módon hasithatják (pl. a glükanázok :  -amilázok,

-glükanázok, stb.), vagy csak specifikus kötéseket hasitanak(pl. egyes proteolitikus enzimek mint a tripszin, amely a fehérjemolekulát a bázikus aminósavaknál hasitja,stb. vagy a DNS-t hasitó restrikciós endonukleázok, amelyek szigorúan determinált bázis - szekvenciánál vágják el a

polimerláncot ).

exo-hatású polimer-hidrolázok , amelyek a polimer valamelyik végérôl hasitanak le alegységeket ( pl. a glükoamiláz, ill. a ^-amiláz

,amelyek a keményitôláncok nem redukáló végérôl hasitanak le glükóz , ill.

maltóz alegységeket , vagy a karboxipeptidázok, ill.aminópeptidázok, amelyek a fehérjék C-, ill. N-terminális láncvégérôl hidrolizálnak

aminósavakat,stb. ).

Az exo-hatású polimer-hidrolázok közül, azoknál lehet az egyedi sebességi állandókat meghatározni, amelyek az u.n. egylánc mechanizmus szerint hasitják a terminális alegységeket. Ilyen enzimeknél az ES komplexbôl képzôdô termék eltávozik az enzimrôl, de a polimer visszamaradt része nem disszociál le az enzimmolekuláról, hanem az enzim mintegy

továbbcsúszik a polimeren és létrejön az új reaktiv ES-komplex. A reakcióséma tehát:

E + S n k1

k-1 ESn k2

P ESn-P k- k1 -1

E+Sn-P

P

k2 ESn-2P k1 k-1E+Sn-2P

k2

P ESn-3P k-1 k1

E+Sn-3P

stb.

Az egylánc mechanizmusnál az egy ES-komplexbôl keletkezô termék- molekulák számát jelöljük N-nel, amely meghatározható olymódon, hogy a kiindulási polimernek izotóposan megjelöljük azt a láncvégét, ahol az enzim a hasitást elkezdi. Belátható, hogy a termék specifikus

radioaktivitásának viszonya a kiindulási polimer specifikus aktivitásához attól függ, hogy hány lépés ( N ) játszódott le egy ES-komplex képzôdés hatására, mennyi az egy hatásos enzim-szubsztrát ütközésre esô

kötéshasadások száma. Mivel ez utóbbi Poisson eloszlást követ, igy

N DP

R





 * ln

2 1

1

(11.34)

ahol  = hidrolizisfok ( kötéshasadások száma / össz hasitható kötés) DP= a szubsztrát polimerizációs foka (degree of polymerization) R= a termék és a polimer spec. aktivitásának aránya.

Az egy hatásos ütközésre ( ES komplex képzôdésre ) jutó kötés-hasadások számát az ES-komplex létidején belül a termékképzési és ES-komplex disszociációs sebességi állandójának aránya határozza meg :

n k

 k

 2

Az n és k2 ismereretében k-1 számolható , a k1 pedig a Km-bôl megkapható.1

1.1.2.5.Sebességi állandók kéttermékes reakcióknál.

Minden hidrolizises reakció két terméket szolgáltat. Egyes hidrolitikus enzimes

reakcióknál azonban elôfordul, hogy a két termék közül az egyik közvetlenül felszabadul, a másik viszont egy kinetikailag stabilis

intermedierbôl képzôdik. Jó példa ezekre a proteázok, vagy az észterázok esete.

Az un. szerin-proteázoknál például a peptidkötés elhasadása után rögtön felszabadul egy

N-terminális termék (P1) , a C-terminális termék (P2) viszont a kötéshasadásnál az enzim

szerin-OH csoportján kovalens kötéssel létrejött acilenzim intermedierbôl viztámadás révén keletkezik:

O O

ll ll

R₁ NH C R  ₂ ^{E OH}^ R₁NH₂   E O C R₂  ^{H O}² E OH R  ₂COOH

Természetesen ilyenkor nem alkalmazható az egyszerû, egy komplexes Michaelis kinetika,

vagy Brigss-Haldane kinetika. A reakcióséma ebben az esetben:

E S  k^k ES ^k ES P^l



1

2

1

1

k₃ E+P2

Állandósult állapotot feltételezve:

    

 

d ES

dt k E S₁  k_1 k₂ ES =0 (11.35)

d ES

dt k ES k ES

l

 ₂  ₃ l =0 (11.36)

Az összes enzimkoncentráció: ^ET  ^E  ^ES  ^ESl (11.37) Az ES-komplex látszólagos disszociációs állandója:

K E S

S ES

l  , behelyettesitve : ^ET ^K _S^{ES ES ES} s

l

 *   l

(11.38) Ebbôl :

   





E ES K ES  

S ES ES K S

T l s Ss

    

és (11.39)

 ^ES

  

 



s

  l

 (11.40)

Az [ES'] kifejezése már bonyolultabb: a fenti differenciál egyenletbôl k ES₂ k ES₃ ^l ; behelyettesitve az [ES] fenti értékét :

  ^{ }

  ^{ } _{ }  

k E ES S

K S k ES

T

s l

l

2  3

  ; átrendezve és [ES'] kifejezve : (11.41)

ES

k E S

K S

k k S

K S

l

T s l

s l

 

 

2

3 2

; a tört számlálója az egyszerû Michaelis egyenletnek felel

meg, nevezôje pedig azt jelöli ki, hogy miként változik az [ES'] annak következtében,

hogy abból képzôdik a P2 termék és ez a lépés a sebesség meghatározó. A két termék képzôdésének idôfüggése ugyanis a következô (11.20.ábra):

t (idô) -2

0 2 4 6 8 10 12

0 5 10

[p]

[P]=vot P1 P2 extrap.P2

extrap.P1

11.20.ábra. Kéttermékes reakció idôfüggése.

Vagyis a P1 termék képzôdése egy hirtelen ugrással (burst-tel) indul, a P2 viszont egy

lag-fázissal. Késôbb mindkettô vo iránytangessel azonos sebességgel folytatódik. Ha a P2 képzôdése nem lenne sebesség meghatározó, akkor a kezdeti termékképzés sebessége:

P v_o*t.

A P1 idôfüggésének leirása: mivel a P1 képzôdése egy a ugrással indul, ezért az extrapolált egyenes egyenlete (az ábrán a=4):

P₁ v_o*t a

De ezt az egyenest egy exponenciális taggal korrigálni kell, igy a tényleges egyenlet:

 

o

t

1      1

 



  (11.42)

ahol ^= a P2 görbe egyenes szakaszának abszcissza metszete (az ábrán ^= 2).

A P2 idôfüggésének leirása: a P2 görbe egyenes szakaszának teljes egyenlete:

 

 

o o

t

2      1

 



 * ^  ^ (11.44)

A vo ebben az esetben : ^{vo k E S}_K^{o T} _S

m

  , ahol ^{k k k} k k

o



2 3

2 3

* és ^{K K k} k k

m s

 l

³

2 3

Az a értéke (levezetés nélkül):

  

 

a k

k k

S

K S E

m

 T





 







 



2

2 3

2 2

* (11.45)

Ábrázolva az 1/vo értékeket az 1/[S] függvényében megkaphatjuk a ko és Km értékeket,

a Km/ko -ból a K's /k2 -ôt. Az ¹_a ábrázolva az 1/ [S] függvényében

a k3/k2-ôt adja, mig [S]>>K's esetén 1/ ^-ból a k2+k3 kapható. Igy minden sebességi

állandóhoz hozzájuthatunk.