a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP

Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

„SCAFFOLD”-OK ELŐÁLLÍTÁSA

Dr. Pongrácz Judit

Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 9. Előadás

kritériumok I.

• Biokompatibilitás – immunreakciók elkerülése

• Felszíni kémia – sejtfunkciók támogatása

• Egymással összeköttetésben lévő pórusok

kialakítása – sejtek egyenletes eloszlásának és erek képződésének támogatása

• Ellenőrzött biodegradáció – az új szövet kialakulásának lehetővé tétele

kritériumok II.

• Mechanikai tulajdonságok – a szerkezet és funkció stabilitása a beültetés után illetve a szöveti

újraképződés során

• Lehetőség különböző gyógyszermolekulák illetve bioaktív anyagok beágyazására és szabályozott felszabadulására

• ECM interakció – beültetés után az ECM kialakulásának támogatása

• Beültetés után az ECM helyettesítése

jelentősége

• Biztosítják a sejtek számára a 3D környezetet

• Beültetés után átmenetileg az ECM-t helyettesíti

• Közvetlenül irányítják a sejtek differenciálódását

• Szerkezetük meghatározza az előállított szövetkonstrukciók tápanyagellátását

I.

• Az oldószerben feloldott „scaffold”-anyagot pórusképző részecskékkel töltött öntőformába öntik

• Oldószer elpárologtatása

• Pórusképző részecskék kioldása

• „Scaffold” bevonat: az öntőformát a feloldott „scaffold”

anyagba mártják

• Egyszerű, könnyű, olcsó technika

• Nem igényel speciális laboratóriumi felszerelést

• A használt szerves oldószerek gyakran mérgezőek, maradványaik nehezen eltávolíthatóak

II.

Oldószer elpárologtatása

Porogén kioldása Oldószer

Polimer Öntőforma Porogén

Porózus szerkezetet kapunk

• A polimert két, egymással nem elegyedő oldószer keverékében oldják fel

• A telített oldatot melegítik

• A magas illetve alacsony polimer-tartalmú fázisok elkülönülnek egymástól

• A hőmérséklet csökkentésével a polimer kiválik a fázishatáron a túltelített oldatokból

• Az oldószert eltávolítják (kivonás, elpárologtatás, szublimáció)

Gázhabosítás

• Speciális felszerelést igényel

• A „scaffold” anyagát

nyomásálló kamrába töltik

• A „scaffold” anyagát szuperkritikus állapotú

széndioxidban „oldják” fel

• A hőmérséklet

csökkentésével gáz halmazállapotúvá válik

• A fázishatáron kicsapódik a feloldott polimer

10 000

1 000

100

10

1

200 250 300 350 400

Hőmérséklet T (K)

Nyomás P (bar)

szilárd

folyadék

gáz

kritikus pont szuperkritikus

állapot

hármas pont

V

Injektor

Gyűjtőlemez

Fémtű Polimer vagy

kompozit oldat

Elektromosan töltött szál Magasfeszültségű

áramforrás

Elektroszövés II.

• Speciális felszerelést igényel

• Sokoldalú, flexibilis technika

• Nincs szükség extrém körülményekre (hő, koaguláció)

• Többféle polimer használható, pl.: PLA, PLGA, selyem fibroin, chitosan, kollagén

• Szálvastagság, pórusméret, szálorientáció könnyedén szabályozható

Szövött biotextíliák

• Speciális felszereltséget igényel

• Az így előállított „scaffold” szabályos, szövött szálakat tartalmaz

• 2D illetve 3D „scaffold” szerkezet is előállítható

• A pórusméret könnyen szabályozható

• Sokoldalú technika, a „scaffold” anyag széles körben alkalmazható és kombinálható

Szövött biotextília

Spontán „összeszerelődés”

• Spontán „összeszerelődés” a molekulák spontán összeállása rendezett struktúrává

• Oldott állapotban az amfofil peptidek nem-kovalens kötésekkel összekapcsolódnak

Amfofil peptidek tervezése

• Foszfoszerin-csoport serkenti a mineralizációt (csontszövet előállításánál)

• RGD motívumok segítik az adhéziót (integrin- kötőhelyek biztosítása)

• Ciszteinek a molekulák közötti keresztkötések létrejöttét teszik lehetővé

• GGG összekötő-motívumok a feji és farki rész között növelik a molekuláris szerkezet

rugalmasságát

Automatikus gyártási technológiák

• „Rapid prototyping”: adott szerkezetű tárgy automatizált előállítása additív technológia felhasználásával

• Gyors technológia, mely azonos minőségű,

szerkezetű, mintázatú „scaffold”-ot eredményez

• Drága módszer, számítógép vezérelt készüléket igényel

Fused deposition modeling (FDM)

• Robotikusan vezérelt készülék

• Polimer vagy más

anyagból készült szálat tesz le a lerakófejen

keresztül több rétegben

• Szilárd felületre vagy

• „Vonalkázva”: ekkor a

később eltávolításra kerülő részekhez más anyagot használnak

• A kicsivel az olvadáspontja alatt tartott, por vagy

granulátum formájú „scaffold” anyagból egy réteget terítenek le (előreprogramozott minta szerint)

• A számítógép-vezérelt lézersugár felmelegíti az anyagot, amely ennek hatására összeáll

(összeolvad anélkül, hogy megolvadna)

• Újabb réteget fektetnek le és olvasztanak össze

• A tárgy 3D szerkezete így rétegenként épül fel

Selective laser sintering (SLS)

7 5

3

Selective laser sintering (SLS)

4

Lézer

„Scaffold” réteg Éppen készülő tárgy Szkenner

1

Dugattyú Roller

Dugattyú

Dugattyú

„Scaffold” anyagot

mozgató rendszer 2

6

BIOKOMPATIBILITÁS

Dr. Pongrácz Judit

Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 10. Előadás

Biokompatibilitás - Definíció

Az anyag azon képessége, hogy a befogadó szervezetben az alkalmazásának megfelelő választ vált ki.

A biokompatibilitás a TE termékek előállításához használt

„scaffoldok” vagy mátrixok azon képessége, hogy olyan szubsztrátként viselkednek, amely támogatja a megfelelő sejtműködést, vagyis megkönnyíti a molekuláris és

mechanikai jelátviteli rendszerek működését az optimális szövetregeneráció érdekében, DE sem az adott sejtekben, sem pedig lokálisan vagy szisztémásan nem idéz elő nem kívánt válaszreakciót.

Régi koncepció: olyan bioanyagok használata, melyek nem lépnek interakcióba a befogadó szervezet („host”) szöveteivel

A bioanyag-tervezés új célkitűzései:

• A bioanyagok aktív módon interakcióba lépnek a

„host” szöveteivel

• Pozitív élettani választ váltanak ki

• Támogatják a sejtek növekedését és differenciálódását

Bioanyagok biokompatibilitása

• A természetből származó anyagok természetüknél fogva biokompatibilisek (pl.: kollagén, fibrin, hyaluronsav)

• A xenogén bioanyagokat a biokompatibilitás eléréséhez

módosítani kell (pl.: borjúkollagén humán felhasználása előtt az immunogén szekvenciákat el kell távolítani emésztéssel)

• Már rekombináns humán kollagén is kapható

• Más xenogén anyagok (pl.: növényi eredetű

poliszacharidok) biokompatibilitását tesztelni kell

• Szintetikus anyagoknál szintén ellenőrizni kell azok biokompatibilitását

Biodegradálhatóság: in vivo makromolekuláris

degradáció; a lebomlási termékek nem eliminálódnak a szervezetből

Bioabszorbeálhatóság: a makromolekuláris

komponensek az anyagcsere megváltozása nélkül jutnak be a szervezetbe

Biológiai felszívódóképesség: a makromolekuláris alkotóelemek lebomlása és metabolizálódása, a molelulatömeg csökkenése, a végtermék

kiválasztása

Biokompatibilitás tesztelése

• A vér/anyag vagy szövet/anyag határfelületnek a lehető legkisebbnek kell lennie

• Álljon ellen a biodegenerációnak

• Fontos, hogy a bioanyag természetes anyagként viselkedjen vér és szövet jelenlétében.

• A beültethetőséget kizárja, ha az anyag:

– Vérrögképződést indít el (Trombózisveszély) – Károsítja vagy szenzitizálja a vér sejtes elemeit

– Megváltoztatja vérplazma fehérjéit (köztük enzimeket) nem kívánt reakciókat előidézve

– Káros immunreakciót indít el – Rákot okoz

– Teratogén

– Toxikus vagy allergiás választ vált ki – Elektrolitvesztést okoz

– Sterilizálás hatással van rá

komplikációk

• A beültetett anyag elleni immunreakció

• Krónikus gyulladás

• Hegszövet képződés

• Fokozott véralvadás (érgraft inkompatibilitás)

• Graft elégtelenség

• Kilökődés

Normál sebgyógyulás

A sebgyógyulás több fázisra osztható, az egyes

szakaszokra a bennük szerepet játszó sejtpopulációk illetve sejtfunkciók egyaránt jellemzőek:

1. Véralvadás 2. Gyulladás

3. Sejtek inváziója és szöveti újraképződés

Az implantátum jelenléte megváltoztatja a gyógyulási folyamatot, ez az un.

idegentest reakció (Foreign Body Reaction, FBR), részei:

• Fehérje adszorpció

• Makrofágok

• Sokmagvú idegentest óriássejtek

• Fibroblasztok

• Érképződés

Az implantátum folyamatos jelenléte egy végső készenléti állapot eléréséhez vezethet (resolution).

Az implantátum sorsa ezután a következő 3 folyamat egyike lehet:

• Reszorpció

• Integráció

• Enkapszuláció (fibrózis)

Idegentest reakció II.

Bioanyag Monociták

Makrofágok Ér

Endotél

Sejt-vándorlás

Fibroblasztokat és kollagént tartalmazó réteg Makrofágokat tartalmazó réteg

Bioanyag

Idegentest típusú óriássejtek

A frusztrált fagocitózis a makrofágok aktivációjához és óriássejtek képződéséhez vezet

Az abszorbeált plazmafehérjék granulocita és makrofág választ indítanak el

Ideiglenes implantátumok:

• A szöveti regeneráció és gyógyulás átmeneti segítése

• Csont graftok, biológiailag felszívódó sebészeti varratok

Állandó implantátumok:

• Hosszú távú fizikai integritás és mechanikai teljesítmény

• Szervműködés hosszú távú helyettesítése

• Műbillentyűk, ízületek, stb.

Biológiailag inert anyagok

Poli-tetrafluor-etilén (PTFE, Teflon®):

• A szervezet számára inert

• Rendkívül alacsony súrlódási együttható (0,05-0,10 a polírozott acélhoz képest)

• Biológiailag inert, az élő szövetekkel nem lép interakcióba

• Ízületi protézisek valamint műbillentyűk felszínének borítására használják

• A szilikonok olyan polimerek, amelyek a biokompatibilis polimerek által általánosan tartalmazott C, H, N, O elemek mellett Si-t is tartalmaznak

• A szilikonok gyógyászati osztályozása: nem

beültethető, rövid- illetve hosszútávra beültethető szilikonok

• Katéterek, csövek, mellimplantátumok, óvszerek előállításához

Biokompatibilis fémek

• Titánium ötvözetek ízületi protézisekhez és fogpótlásokhoz

• Kitűnő mechanikai sajátságok

• Nem toxikusak, és nem lökődnek ki

• Egyedülálló osseointegrációs képesség

• A beültetést megelőzően alkalmazott hidroxiapatit borítás elősegíti az osseointegrációt

• A hidroxiapatit (HA) természetes állapotban a csontokban és a fogakban megtalálható

• HA kristályokat gyakran más polimerekkel kombinálják a „scaffold” előállítás során

• Mikrokristályos HA táplálékkiegészítőként is kapható a csontritkulás megelőzésére

• Jobb, mint a CaCO₃ az oszteoporózis megelőzésében

bioabszorbeálható polimerek

• Leggyakrabban használt bioanyagok

• Fő felhasználási terület: felszívódó varratok, gyógyszerhordozó „scaffold”-ok, ortopédiai protézisek

• Poliészter láncok

• Egyszerű hidrolízissel történő biodegradáció

• A keletkező a-hidroxi-savak különböző

anyagcsereutakon át eliminálódnak (pl.: citromsav ciklus) vagy módosítás nélkül a vizelettel távoznak

Leggyakrabban használt poli-a-hidroxi-savak:

• Poli-tejsav (PLA)

• Poli-glikolsav (PGA)

• Poli-kaprolakton (PCL)

Degradációs termékeik a citrátkörbe lépnek be

Poliészter Hidroxi-terminális Karboxi-terminális

H₂O (CH₂)_nCO(CH₂)_n C

O O

HO(CH₂)_n CO O

(CH₂)COH O

+

Poli-a-hidroxi-savak biodegradációja II.

PGA

PLA H₂O

Glikolsav Glicin

Szerin

Tejsav Piruvát

CO₂ Acetil-KoA

Citromsav

Citrátkör

Oxidatív foszforiláció

CO₂ b-Hidroxi-butirát

Acetoacetát

H₂O H₂O PDS

PHB Észteráz

Vizelet

H₂O

ATP

PGA = poli-(glikolsav) PLA = poli-(tejsav) PDS = poli-(d-dioxán)

PHB = poli-(hidoroxi-butirát)

Típus Polimer Jelenlegi felhasználás

Poliészter

Politejsavak

Poli-(L-tejsav), [PLLA]

Poli-(D, L-tejsav), [PDLLA]

• Felszívódó varratok

• Csontprotézisek

• Csont-, máj- és idegszövet

konstrukció számára „scaffold”-ként

• Gyógyszerhordozóként (többféle)

Poliészter Tejsav-glikolsav kopolimer, [PLGA]

• Szabályozott hatóanyag-leadási rendszerként (fehérjék és

kismolekulájú gyógyszerek)

• TE „scaffold”

• Gyógyszerhordozóként (többféle)

• Génátvitel Poliészter Poli-(ε-kaprolakton), [PCL]

• Lassú szabályozott hatóanyag- leadási rendszerként –

gyógyszerhordozóként (pl.: > 1 év)

Poli-(Glikolsav), (PGA)

• PGA merev, erősen kristályos anyag

• Kizárólag erősen apoláros szerves oldószerekben oldódik

• Főként felszívódó varratokban használják (Dexon®)

• SCPL technikával „scaffold” előállítás

• Tömeg-degradáció

• Természetes lebomlási termék (glikolsav)

• D, L izoformák és racémek keverékei

• Leggyakrabbab az L izoformát használják együtt PGA-val: PLGA kopolimer

• PLGA egyike azon kevés polimernek, amelyet humán felhasználásra fejlesztettek ki

• PGA és PLLA kopolimerjei széles körben felhasználhatóak

• A degradáció sebessége illetve típusa a kopolimer összetételétől függ

Politejsavak biodegradációja

• Általános lépés az észterkötések random hidrolízise

• A degradáció típusa és sebessége az összetételtől függ

• A lebomlási termékek nem toxikusak, nem váltanak ki gyulladást

• Nagyméretű ortopédprotézisek esetén azok savas degradációja toxikus termékeket eredményezhet

• Kisebb darabok törhetnek le az implantátumról, melyek gyulladást okozhatnak

• Szemikristályos polimer

• Nagyon lassú degradáció (a tiszta PCL 3 év alatt bomlik le, más kapronokkal alkotott kopolimerjei könnyebben degradálódnak)

• Hosszabb távú gyógyszerhordozásra használják

• A PCL-t biokompatibilis, nem toxikus anyagként tartják számon

Polimer erózió

• A víz beszivárog az anyagba, a polimer amorf fázisának kémiai kötéseit hasítja, így a hosszú

polimerláncokat rövid vízoldékony darabokra bontja.

• Ennek következtében a molekulatömeg csökken, a fizikai tulajdonságok viszont nem változnak, hiszen a kristályos fázisok összetartják a polimert. A víz átjárja az anyagot, és a fragmensek metabolizálódását és tömegerózióját indítja el.

• A polimer felületi eróziójáról akkor beszélünk, ha a

polimer gyorsabban alakul át vízoldékony anyagokká, mint ahogy a víz beszivárog a konstrukcióba.

Idő

Degradáció

Tömegerózió Felületi erózió

Degradáció I.

• Biológiailag lebomló hidrogélek: a vízoldékony polimerláncok közötti kémiai keresztkötések hasítása

• Felületi erózió a jellemző

• A tömegveszteség lineáris a degradáció során

A polimerlánc hasítása vízoldékony monomereket eredményez

−(CH − C − O − CH − C − O −)_x−(CH₂ − C − O − CH₂ − C − O)_y− −HO − CH − C − OH + OH − CH₂ − C − OH

CO₂ + H₂O H₂O

Krebbs ciklus

O CH₃

O CH₃

O O

CH₃

O O

Degradáció III.

• Polimer hidrofóbicitás: a hidrofóbicitás növekedése nagyobb stabilitást eredményez

• Bulky szubsztitúciós csoportok (pl.: metil-csoport PLA esetén) növeli a degradációs időt (PGA<PLA)

• Üvegesedés: Az üvegesedési hőmérséklet (Tg) felett a rugalmassá váló polimerek láncai

mozgékonyabbak, így a víz számára könnyebben hozzáférhetőek

• Kristályos szerkezet csökkenti, az amorf struktúra növeli a degradáció időtartamát