Fehérje hatóanyagok vizsgálata bioassay módszerekkel
Dr. Rábai Erzsébet
Richter Gedeon Nyrt.
„TOTALITY OF EVIDENCE”
2
Biológiai karakterizálás
• Állatkísérleteknek nincs értelme – az antitestek fajspecifikusak
• A biológiai karakterizálást a klinikai vizsgálat követi
• Nagy a hangsúly az összes hatásmechanizmust korrektül modellező módszerek eredményein
– Biohasonlóság igazolása
Biológiai vizsgálatok
2. Funkcionális
• Fab régióhoz
kapcsolódó funkciók
• neutralizáció
• receptor aktiváció, pl.
proliferációgátlás
• Fc régióhoz kapcsolódó effektor funkciók
• ADCC (antitestfüggő sejtes citotoxicitás)
• CDC (komplementfüggő citotoxicitás)
• Stb.
1. Kötési
• antigén
• Fcγ receptorok
• FcRn receptorhoz
• komplementkötő képesség (C1q)
antigénkötés
Fc-függő effektor funkciók
Surface Plasmon Resonance (SPR)
• Kötődés hatására megváltozik a felszín (változás a refraktív indexben)
• A változás arányos a felszínre kötődött anyag mennyiségével
• Előnyök:
• Nem szükséges jelölés
• Folyamatos követés (real time)
• Olyan adatok számolhatók vele, melyek a kötést jellemzik
• Hátrány: immobilizálás szükséges
• Megválaszolható kérdések:
• Mennyire specifikus a kötődés?
• Milyen gyors a kölcsönhatás (ka)?
• Milyen stabil a komplex (kd)?
• Milyen erős a kölcsönhatás (K )?
Áramlás
Asszociáció (ka)
Disszociáció (kd) Egyensúly
Flow
Flow cell
Dissociation Binding
Equilibrium
From binding to SPR sensorgram
6
Octet Red
Bio-layer interferometria (BLI)
Sejtes kötési assay
8
Sejtalapú biológiai vizsgálatok
• A sejteken a hatóanyag által kiváltott
– Proliferáció
– Receptoraktiváció – Apoptózis
– Sejtpusztulás – Citokintermelés – Génexpresszió – stb.
– EC50 változékonysága
1E-3 0.01 0.1 1
20 30 40 50 60 70
Data: Data1_B Model: Logistic
Equation: y = A2 + (A1-A2)/(1 + (x/x0)^p) Weighting:
y No weighting
Chi^2/DoF = 2.2154 R^2 = 0.99243
A1 22.09543 ±0.64478 A2 63.37981 ±0.76899
x0 0.05739 ±0.00443
p 0.98692 ±0.07283
%
RTX ug/ml
Drug, g/ml
Megoldás: referenciához viszonyított, relatív mérések
10
Lineáris, 4 PL és 5 PL modell
treatment 1 treatment 2 treatment 3
Ha a görbék nem párhuzamosak
12
Proliferációs bioassay
• Az NFS60 egér leukémia sejtekben a pegfilgrasztim proliferációt indukál
• 96 órás pegfilgrasztim kezelés, AlamarBlue detektálás
• Értékelés: „parallel line”
analízis treatment 1 treatment 2 treatment 3
NFS60 sejtek kiültetése
Pegfilgrasztim kezelés Proliferáció
Detektálás:
AlamarBlue
Értékelés
13
Fő hatásmechanizmusok, példa: rituximab
14
Apoptózis
Apoptózis
• CD20 kötése által kiváltott folyamat
• 4 napos vizsgálat
• AlamarBlue detektálás
16
Komplementfüggő citotoxicitás (CDC)
Komplementfüggő citotoxicitás (CDC)
• CD20-at hordozó célsejt
• Rituximab kötődése hatására aktiválódik a komplement-rendszer
membránkárosító komplex (MAC) lízis
• Detektálás: AlamarBlue
18
Antitestfüggő sejtes citotoxicitás (ADCC)
Hagyományos antitestfüggő sejtes citotoxicitás (ADCC)
• CD20-at hordozó célsejtek
• FcRIIIa-t hordozó természetes ölősejtek
• A rituximab az antigénhez és az Fc receptorhoz kötődése által összekapcsolja a sejteket, és aktiválja az ölősejtet
• Hatására citotoxikus fehérjék szabadulnak fel lízis
20
Hagyományos ADCC bioassay
• Végpontja: citotoxicitás
• Effektorsejtek: PBMC vagy sejtvonalak
• Variabilitás
• Reprodukálhatóság problémás
Riportergénes ADCC bioassay
22
Az ADCC bioassay kivitelezése
Diagram For Conformational Comparability Array
24
Antibody amino acid sequence is used to design the antibody array with overlapping regions to cover the whole mAb molecule
mAb Amino Acid Sequence
Individual peptides to raise Polyclonal antibodies.
Technology Development
Diagram of the Sandwich ELISA
26
H2N NH2
HN NH
Anti-peptide Antibody
Therapeutic Protein
Biotinylated Anti-human IgG Antibody
Streptavidin Horse Radish
Peroxidase
TMB
Oxidized TMB
Conformational Array Can Detect Differences Not Detected by Bioassay
OD 450 nm
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Ab1 Ab2 Ab3 Ab4 Ab5 Ab6 Ab7 Ab8 Ab9 Ab10 Ab11 Ab12 Blank
mAb1 Reference
mAb1 pH4 50°C (Bioassay shows difference) mAb1 pH6 50°C (Bioassay No Difference) KLH
