a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP

(1)

az Európai Unió új társadalmi kihívásainak

a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

(2)

SEJT-AGGREGÁCIÓS KULTÚRÁK

Dr. Pongrácz Judit

Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 15. Előadás

(3)

Aggregációs sejtkultúrák

• Az aggregáció segítségével gyorsan alakíthatunk ki kisméretű szövetdarabkákat

• Az aggregáció szoros kapcsolatot alakít ki a sejtek között, amely segít növelni a sejtek túlélését és

megfelelő élettani funkcióinak végrehajtását

(4)

Alapvető feltételek az aggregációs kultúrák kialakításához

• Sejtadhéziós molekulák (CAM, cellular adhesion molecule) jelenléte a sejtfelszínen

• Mátrix vagy mesterséges összetapadást segítő molekulák jelenléte, amely serkenti azon sejtek

aggregációját, amelyek egyébként nem tapadnának össze

(5)

Sejtadhézió

Sejt-mátrix interakciók

Oldott állapotú ECM

Integrinek

Statikus ECM Kadherinek

Sejt-sejt interakciók

(6)

A sejt-aggregáció kialakításának módszerei

Aggregáció gravitációs kultúrákban

Aggregáció alacsony tapadóképességű

anyagokhoz

Aggregáció scaffoldokon vagy kémiailag módosított felszínű

anyagokon Aggregáció forgó vagy

szuszpenziós kultúrákban Aggregáció bioreaktorokban

(7)

Gravitációs sejtkultúrák

A sejtek „gömböcskék”-ké, ún. szferoid-okká állnak össze természetes módon, természetes nagyságú vagy megnövelt gravitációs mezőben

Gravitációs kultúrák típusai:

• Szuszpenziós kultúrában kialakuló aggregátumok bioreaktorokban

• Függőcsepp-kutúrák

• Centrifugált aggregátumok

(8)

Szuszpenzióban kialakuló aggregátum kultúrák

• Magas sűrűségű sejtszuszpenziók szükségesek a kialakuláshoz

• A tenyésztés dinamikusan mozgásban levő kultúrákban lehetséges, a sejt-sejt kapcsolatok kialakulásához

szükséges találkozások számának növelése érdekében

• A dinamikusan mozgásban levő sejtkultúrák kialakítására a sejtszuszpenziókat lehet mozgásban levő lemezeken, petri- csészékben vagy bioreaktorokban tenyészteni

(9)

Aggregáció forgó bioreaktorokban

Forgó bioreaktor

Adherens sejtekhez

Forgó bioreaktor

Sejtszuszpenziókhoz

Mintavevő nyílások Töltőnyílás

LSMMG

NG Gravitációs

erő

Gravitációs erő

Forgásirány Mintavevő

nyílások

Töltőnyílás

Forgásirány

(10)

Bioreaktorok és sejt-aggregáció

Rotációs bioreaktor: speciális bioreaktor, amelyben a sejtekre ható erők egyensúlya tartja szuszpenzióban a az

aggregátumokoat. A nyíróerők minimálisak. Típusok:

• High aspect rotation vessel (HARV)

• Slow turning lateral vessel (STLV)

Kevertetett bioreaktorok: különböző térfogatú edények léteznek, ipari célokra akár több, mint 100 l térfogat

(11)

Különböző sejttípusok aggregátumainak tenyésztése bioreaktorban

Bioreaktor típus Sejttípus

Forgó bioreaktor

HepG2 sejtek, humán őssejtek, humán bőr fibroblasztok, humán embrionális vesesejtek

Kevertetett bioreaktor

Porcsejtek, primer egér és patkány májsejtek, L6 mioblasztok, CHO sejtek

(12)

Sejt-aggregátumok felhasználása

Sejt-aggregátumok Felhasználás

CHO Rekombináns fehérjék

szintézise Humán embrionális

őssejtek

Embrionális test (EB)

kialakulása és differenciáció

(13)

Microgravitációs sejtkultúra – Függőcsepp I.

Vájt tárgylemez

A mintát kaccsal a fedőlemezre helyezzük

Olajcsepp Vazelin

180°

(14)

Microgravitációs sejtkultúra – Függőcsepp II.

180° 180°

180°

Idő (napok)

Az embrionális testek növekedése és a spontán csíralemez-differenciálódás megkezdődik

0

2

5

(15)

Egyforma embrionális testek tenyésztéséhez és az

intercelluláris kapcsolatok szabályozásához szükséges mikrolemezek

40 mm

150 mm

(16)

Aggregáció alacsony adherenciájú felszínhez

• Az alacsony adherenciájú felszín segíti a szuszpenziós sejtkultúrák kialakulását

• A sejt-sejt kapcsolatok növekednek

• Néhány ECM-származékkal (pl. Martigel) borított felszín növeli a sejtek motilitását és sejtek közötti aggregációt.

(17)

A magas proliferációs képességgel rendelkező májsejtek szelekciója

Természetes aggregáció

PVLA potenciálisan jól használható mesterséges máj kialakítására a különböző koncentrációjú borítások

révén

PVLA (Poli-N-p-vinil venzil D-laktóz lakton amid)

ASGP-R

Egyéb Integrin

EGF-R HGF-R

Fas

Májsejtek ASGP-R^magas lassú proliferáció

Szferoid kialakulása

Májsejtek ASGP-R^alacsony gyors proliferáció

+EGF

Sejtalak szabályozása

Szferoid

100 mg/ml PVLA-val borított edény

PVLA bevonat koncentrációja

15-20 ng/ml PVLA-val borított edény

Kitapadás

1 mg/ml PVLA bevonat

100 mg/ml PVLA bevonat Lekerekedés

E-Kadherin Epevezeték

Májsejt

(18)

Sejtaggregáció serkentése mesterséges módszerekkel

Polimerből álló híd képzése a sejtek között.

Típusok:

• Természetes adhéziós molekula

• ECM-eredetű molekula része

• Polimer mátrix

(19)

Mesterséges sejt-aggregáció

Aggregálódott sejtek Sejtek

Bifunkcionális polimer

(20)

Sejtek keresztkötése biotinnal

Avidin

Sejtaggregátum Biotin

hidrazid

Perjodát-funkcionalizált sejtek

(21)

Felszínek kémiai módosítása

• Chitosan, természetes, biodegradábilis polimer (molekulatömeg: 810 kDa)

• Kémiailag módosított PEG (polietilén glikol)

• Laktonnal módosított eudragit

• PLGA nanogyöngyök

• Lektinek és származékaik

(22)

Chitosan

(23)

Kémiailag módosított PEG

MA(PEG)_n

Methyl-PEG_n-Amine

Methyl-(#ethyleneglycol) amine H₂N

CH₃ O

O

MA(PEG)₈ M.W. 383.48 Spacer arm 29.7 Å

[ ]8

CH₃ H₂N

O

MA(PEG)₁₂ M.W. 559.69 Spacer arm 43.9 Å

H₂N [ ]12

CH₃ O

MA(PEG)₂₄ M.W. 1088.32 Spacer arm 86.1 Å

[ ]24

CH₃ H₂N

O

(24)

Lakton-módosított eudragit

pH > 6

HOOC

COOH

COOH HOOC

COOH

Ellenionok Ko-ionok

COO- -OOC

-OOC

COO-

+ -

+

+ - - +

(25)

PLGA nanogyöngyök

Oldott polimer (PLGA)

Diszperziós fázis

Pumpa

Előkeverés

Mágneses keverő

Magasnyomású víz befolyás

Magasnyomású víz kifolyás

(26)

Lektinek és származékaik I.

• A sejtfelszíni molekulák szénhidrátcsoportjait képesek megkötni a lektinek

• A lektinek, vagy fitohemagglutininek (PHA), olyan fehérjék, melyeknek nincsen sem enzimatikus sem immunológiai aktivitásuk, és reverzibilisen képesek szénhidrátokhoz kötődni azok megváltoztatása

nélkül

• Mivel a lektinek specifikus, reverzibilis sejt-sejt adhéziós reakcióban vesznek részt, jól

alkalmazhatóak sejtfelszíni molekulák keresztkötésén keresztül a sejtadhézió serkentésére

(27)

Lektinek és származékaik II.

• Hat lektin család ismeretes:

– Legume lektinek (a pillangósvirágúak családjában) – Gabona-eredetű lektinek,

– P-, C-, és S-típusú lektinek (állati fehérjék) – A pentraxinok (állati fehérjék)

• A lektinek sokfajta sejttípushoz kötődnek, amelyek különböző sejtfelszíni glikoproteinek vagy glikolipidek alkotórészei. A sejtek lehetnek

vörösvértestek, leukémiás blasztok, élesztőgombák vagy baktériumok.

• A lektinek szénhidrátspecificitása is különböző lehet, mannóz, galaktóz, N-acetil-glükózamin, N-acetil-galaktózamin, L-fruktóz, és N-acetil-

neraminsav.

• Mivel egy lektinmolekulán több szénhidrát-kötőhely található, képes agglutinálni a sejteket.

• A lektinek kötődése az egyes szénhidrátokra specifikus.

(28)

A lektinek által felismert N-glikánok típusai

Type PHA

Bisected di-, tridiantennary complex-type N-glycan

Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin (E-PHA)

Inhibitor: GalNAc Tri- and tetraantennary

complex-type N-glycan

Phaseolus vulgaris Leukoagglutinin (L-PHA)

Inhibitor: GalNAc Tri- and tetraantennary

complex-type N-glycan

Datura stramonium Agglutinin (DSA)

Inhibitor: Chitotriose (GlcNAc₃)

(29)

Sejt-aggregáció scaffoldokon

• Homogén és heterogén sejtpopulációk aggregációja

• Sejtfelszíni fehérjék biotinálása és avidin alkalmazása keresztkötő ágensként

(30)

Nanoszerkezetű scaffold-ok

• Spontán összeszerelődő scaffold-ok

• Nanokompozit anyagok

• Nanoszálak

(31)

Nanoszerkezetű anyagok felhasználása

Anyag Jellemzők Felhasználás

Fullerének

Szénatomok hexagonális és pentagonális térszerkezetbe rendeződve

Gyógyszerek enkapszulációja, képalkotó vizsgálatok

Fluoreszcens

„Quantum dot”-ok

Félvezetőkből készült

nanokristályok Bioszenzorok, képalkotás Liposzómák Foszfolipid membránnal

burkolt vezikulák

Gyógyszerek leadása, génterápiás alkalmazás Dedrimerek Polimer szerkezetek Gyógyszerek leadása,

génterápiás alkalmazás Arany nanorészecskék Kolloid arany Bioszenzorok, sejtszintű

képalkotás Szuper-paramágneses

vas-oxid Vas-oxid MRI kontrasztanyag

(32)

SZÖVETEK

NYOMTATÁSA

Dr. Pongrácz Judit

Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 16. Előadás

(33)

A szövetnyomtatás alapjai

• Scaffoldmentes konstrukció

• Tisztított sejtek aggregált halmazait alkalmazzák

• A sejthalmazokból áll a „biotinta”

• A 3D szövetkonstrukciók felépítése a sejthalmazok spontán fúziós képességén alapul

(34)

Sejthalmazok fúziója 3D szövet-

konstrukciókká I.

(35)

Sejthalmazok fúziója 3D szövet- konstrukciókká II.

Közel helyezett sejtaggregátumok és embrionális szív mezenchima fragmentek gyűrű vagy csőszerű struktúrákká egyesülnek

(36)

Szervek nyomtatása

3D nyomtatás: a sejthalmazokat gyors, automatizált módszerrel rétegenként, biokompatibilis anyaggal körülvéve helyezzük egymásra, így alakul ki a 3D szerkezet.

Szövetnyomtatás típusok:

• Lézernyomtatás (osteoszarkóma, embrionális carcinoma)

• Tintasugaras nyomtatás (hippocampális és kortikális neuronok)

(37)

Az első szövetnyomtató

(38)

Érett, szervspecifikus primer sejtek I.

Biopszia Tisztítás

Sejtkultúra

TE-ben

használható sejtek

(39)

Érett, szervspecifikus primer sejtek II.

Biopszia

Tisztítás

TE-ben használható

sejtek

Differenciálódott szöveti sejtek

Szövetspecifikus

rezidens őssejtek Sejtkultúrák

(40)

Érett, differenciálódott sejtek alkalmazása TE céljára

• Forrás: biopszia vagy reszekció

• Tisztítás

• Expanzió in vitro tenyésztés során

• Újradifferenciáltatás

(41)

Vérerek képzése szöveti nyomtatással

Fontos a megfelelő nyomóerő alkalmazása

(42)

TE-vel előállított erek potenciális alkalmazása

• Koszorúér betegség, bypass készítése

• Trombózis kezelése

• Baleseti érsérülés

• Komplex szöveti szerkezetek kialakítása TE-vel