az Európai Unió új társadalmi kihívásainak
a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen
Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
INTRACELLULÁRIS/
NUKLEÁRIS RECEPTOR JELÁTVITEL
Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Berki Tímea és Boldizsár Ferenc Jelátvitel
Történeti háttér
• G. T. Beatson skót sebész inoperábilis emlőrák regresszióját írja le ovariektómia után
• Az állatok kasztrációja javítja a hús minőségét
• Ősi kínai orvoslás placenta extraktumot használ
• 1926 Kendall ésReichstein kortizon és tiroxin
• Butenandt/Doisy ösztrogén (terhes nő vizeletében)
• Androszteron és progeszteron (sertés corpus luteumból izolálták)
• “estrus” ~ “oistros” (Greek) = bögöly
• 1961 Jensen: ösztrogén receptor
• 1980-as évek: ER, GR, TR klónozása (Chambon, Evans és Vennström)
Hatásmechanizmus
• Nukleáris receptorok a sejtekben található fehérjék, amelyek a szteroid és thyroid hormonok és más
lipofil molekulák érzékelését végzik
• Ligand kötődése a nukleáris receptorhoz annak
konformációváltozását idézi elő, amely aktiválódva, transzkripciós faktorként viselkedik
• A receptor aktivációja gének átíródásának
fokozását vagy gátlását eredményezi.
Transzkripciós faktorok
Transzkripciós faktorok: szekvencia-specifikus DNS- kötő faktorok
• Szabályozzák a DNS genetikai információjának átíródását mRNS-re
• Aktivátorként hatnak (= segítik a génexpressziót)
vagy represszorok (= gátolják a génexpressziót)
szabályozva az RNS polimeráz toborzását
Transzkripciós faktorok vizsgálata
Transzkripciós faktor aktivitás:
• Luciferáz teszt
• Kromatin immunoprecipitáció (ChIP)
• Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Transzkripciós faktor interakció:
• Ko-immunoprecipitáció
Luciferáz riporter assay
1. A célsejt transzfekciója Luc Vectorral 2. A sejtek aktiválása
3. Signaling, TF aktiváció 4. Luciferáz szintézis
5. Fényelnyelődés mérése
Promóter Reporter gén RNS polimeráz és
transzkcripciós faktorok
Transzkripció
mRNS
Transzláció
Reporter fehérje
Ligandok
Lipofil hormonok: A keringésben transzport fehérjékhez kapcsolódnak; a plazmamembránon transzport fehérjéhez kötődve vagy passzívan lépnek át
17-b-ösztradiol Ösztrogén receptor
(ER)
Tesztoszteron Androgén receptor
(AR)
Kortizol
Glükokortikoid receptor (GR)
Kalcitriol D-vitamin receptor
(VDR) Trijódtironin (T3)
Tiroid hormon receptor (TR)
A-vitamin Retinsav receptor
(RAR)
A nukleáris receptorok faji megoszlása
• A nukleáris receptorok állatokra jellemzőek,
algákban, gombákban és növényekben nincsenek
• A C. elegans-nak 270 ismert receptora van
• Számos orphan receptor létezik!!!
• Az emberi nukleáris receptorok száma 48, egérben és patkányban 49 illetve 47 nukleáris receptort
találtak
Intracelluláris receptorok
Szteroid hormon rec. Ösztrogén rec. (ER) Ösztradiol Glükokortikoid rec. (GR) Kortizol Mineralokortikoid rec. (MR) Aldoszteron Androgén rec. (AR) Tesztoszteron Progeszteron rec. (PR) Progeszteron Tiroid hormon rec. Tiroid hormon rec. (TR) T3
Retinoid rec. Retinsav rec. (RAR) All-transz-retinsav Retinsav X rec. (RXR) 9-cisz-retinsav
D-vitamin rec. D-vitamin rec. (VDR) 1,25-hidroxi-kolekalciferol Lipid szenzorok Máj X rec. (LXR) Oxiszterolok
Farnesoid X rec. (FXR) Epesavak
PPAR Peroxiszóma proliferátor
aktivált rec.
Zsírsavak, eicosanoidok (pl. LT-k, PG-k)
Nukleáris receptor családok
GR GR
Szteroid Recetorok
Glükokortikoid Mineralokortikoid Progeszteron Androgén GR
MR PR AR
Dimer „Orphan”- Árva Receptorok
RXR COUP HNF-4 TR2 TLX GCNF
9-cisz RA
RXR RXR
Monomer „Orphan” - Árva Receptorok
NGFI-B SF-1 Rev-erb ROR ERR
RXR T3R
RAR VDR PPARa PPARg EcR FXR CAR LXR PXR/SXR
RXR Heterodimerek
Tiroid hormon All-transz RA 1,2,5-(OH)2-VD Zsírsavak 15d-Δ12,14-PGJ Ekdizon Epesav Androsztán Oxiszterol Xenobiotikumok
RXR R
A nukleáris receptorok szerkezeti felépítése
AF-1: aktivációs funkció 1 (ligand-független) AF-2: aktivációs funkció 2 (ligand-függő)
AF-1 AF-2
A/B C D E F
N-terminális domén Hinge régió C-terminális domén
DNS-kötő domén (DBD) Ligand-kötő domén (LBD) Dimerizáció
200-250 aminosav, mérsékelten konzervált 50-500 aminosav, variábilis
70 aminosav, konzervált
A szteroid receptorok hatás- mechanizmusai
HSP GR GR
GR
HSP
GR
HRE
Ko-aktivátor polimeráz RNS GR
GR
Ko-aktivátor
polimeráz RNS
Ko-aktivátor polimeráz RNS RXR R
HRE
Ko-aktivátor
polimeráz RNS
Ko-aktivátor polimeráz RNS
HRE RXR RXR Ko-represszor
Hormon
Sejtmag Plazma membrán
Citoplazma
Ko-represszor RXR R
HRE
Transzkripció Transzkripció Transzkripció
A GC hatás időbeli lefolyása
GRE Ezred-
másodperc (?) Másodpercek
-percek (?) Órák-napok
Ko-regulátorok
TF-ok
Sejtmag Dimerizáció
Kötődés Molekulák
találkozása
?
? Szabályozás
szintjei
CBG kötés a vérben
MDR a membránban
Metabolizmus és a nukleáris receptor
sorsa
Transzkripció
MR/GR Szteroid
NR-ok típusai
• I-típusú nukleáris receptorokhoz tartoznak a 3-as alcsoport receptorai, mint az androgén receptor, ösztrogén receptorok, glükokortikoid receptor és progeszteron receptor
• II-típusú nukleáris receptorokhoz főleg az 1-es
alcsoport tartozik, mint a retinsav receptor, retinoid
X receptor és tiroid hormon receptor
I-típusú receptor hatás
Sejtmag Plazma membrán
Citoplazma Hormon
NR HSP NR NR
HSP
NR
HRE
Ko-aktivátor polimeráz RNS NR
NR Ko-aktivátor
polimeráz RNS mRNS
Célgén
mRNS
Fehérje Megváltozott sejtműködés
I-típusú NR jellemzői
• Ligand hiányában a citoszolban találhatóak
• Hormon kötődése a receptor disszociációját okozza a hősokkfehérjéről (Hsp), majd annak dimerizációja után a receptor nukleáris transzlokációját
• A sejtmagban specifikus DNS szakaszokhoz (Hormone Response Element, HRE) kapcsolódik
• A NR-DNS komplex egyéb fehérjék toborzását indítja el, amelyek felelősek a transzkripció és új fehérjék
transzlációjának elindításáért, amely végül a sejt funkciójának megváltozását eredményezi
A citoplazmatikus receptor komplex
• Hsp90, 70, 40 + ko-chaperone p23 + immunophilin (pl. FKBP52): dynein-hez (motorfehérje) kapcsolja a komplexet
• Dinamikus összekapcsolódás-szétkapcsolódás
• Ligand-kötött receptorok a mikrotubulusok mentén
transzportálódnak a nukleáris pórusokhoz
II-típusú receptor hatás
Ko-aktivátor polimeráz RSA RXR TR
HRE
Ko-represszor Ko-aktivátor
polimeráz RNS
Sejtmag Plazma membrán
Citoplazma
mRNS
Célgén
mRNS Fehérje
Megváltozott sejtműködés Hormon
Ko-represszor RXR TR
HRE
II-típusú NR-ok
• A ligand jelenlététől függetlenül a sejtmagban
helyezkednek el, általában hetero-dimer formában (általában RXRel) kapcsolódnak a DNS-hez
• Ligand hiányában a II-típusú nukleáris receptorok
gyakran ko-represszor fehérjékkel kapcsolódnak
Nukleáris receptor heterodimer formája
PPRgamma (zöld) és RXR alpha (kék) kettősszálú DNS-sel komplexben (lila), NCOA2 ko-aktivátor peptiddel (piros).
DNS kötés
DNS kötőhelyek (= Response Elements):
• 2x6 bázispár
• Szteroid rec. (homodimer): palindrom, invert ismétlődő szakaszok 3bp spacer-rel elválasztva (IR3)
– GR, MR, PR, AR: 5’-AGAACA-3’
– ER: 5’-AGGTCA-3’
• Nem-szteroid rec.: 5’-AGGTCA-3’direkt ismétlődő szakaszok (DRn, n=spacerek száma)
– homodimerek (pl. TR, VDR)
– heterodimerek (pl. TR, VDR, RAR, LXR, FXR, PXR, CAR, PPAR)
A NR-ok genomikus hatása
Ligand
LBD
DBD RE
szerkezete
A humán progeszteron receptor DNS-kötő doménjének dimerje (kék és zöld) és kettősszálú DNS (lila) komplexe. A cinkatomokat szürke pontok jelölik.
Gén szabályozás
Transzaktiváció:
• Ligand-kötött receptor ko-aktivátorokat toboroz →
transzkripció aktiválása: interakció általános transzkripciós faktorokkal + kromatin felnyitása (ATP-dependens kromatin remodeling/hiszton acetiláció)
• Ligand-kötés → ko-represszor disszociáció → ko-aktivátor kötése
Transrepresszió:
• Ligand hiányában a transzkripció folyamatos, ligand-kötés gátolja a transzkripciót
szelektivitás
• Bizonyos nukleáris receptorok nemcsak közvetlenül kapcsolódnak DNS szakaszokhoz, hanem képesek
transzkripciós faktorokhoz is kötődni. Ez a kötődés általában a másik transzkripciós faktor inaktiválását eredményezi.
• Bizonyos GR ligandok, un. szelektív glükokortikoid receptor agonisták (SEGRA-k) képesek a GR-t úgy aktiválni, hogy az erősebb transzrepressziós, mint transzaktivációs hatású
• Ez a ligand-szelektivitás lehetővé teszi olyan ligandok
kifejlesztését, amelyek erősebb gyulladásgátló hatásúak, kevesebb nemkívánatos metabolikus mellékhatást okozva
A NR-ok szabályozása
A transzkripciós aktivitás növelése:
• Foszforiláció:
– Ser maradványok az N-terminális A/B doménen – Ciklin-dependens kinázok
– PKC, PKA – ERK
– PKB/Akt – JNK/SAPK – p38-MAPK
• AF-1: CDK, ERK, JNK, p38-MAPK, PKB
• AF-2: Src az ER-nál
A NR-ok szabályozása
A transzkripciós aktivitás gátlása:
• A DNS-kötő domén (DBD) foszforilációja PKC vagy PKA által
Terápiás lehetőségek – hormon analógok
• Glükokortikoidok: anti-inflammatorikus, immunoszupresszív kezelések (pl. autoimmun betegségek, transzplantáció,
egyes leukémiák)
• Szexuál szteroidok: szubsztitúciós terápia (endokrin betegségek), fogamzásgátlás, emlőrák
• Tiroxin: tiroidectomia után szubsztitúciós therápia
• A/D-vitamin deficiencia
