Szerves reakciók, szubsztrátumok előállítása

A karbo- és heterociklusos hattagú rendszerek fontos szubsztrátumok, melyekből biooxidatív úton értékes aszimmetrikus molekulák állíthatók elő. A fermentálható prekurzorok szerkezeti összetettségének növelése érdekében meg kellett alkotni egy gyors és hatékony módszert a karbo- és heterociklusos rendszerek létrehozására. Elsőként összegyűjtöttem azokat a vegyületeket (ciklopentadién, furán és pirrol-1-karbonsav-metilészter), amelyek alkalmas prekurzorok lehetnek cisz-3,5-diszubsztituált cikloketonok előállítására. A bejuttatásra váró olefinkötés a szubsztrátumok oldalláncaiban funkcionális bázisként szolgálhatna a későbbi biotranszformációkban, hiszen a C=C kettőskötés inert a mikrobiális Baeyer-Villiger oxidációkban (Mihovilovic et al., 2003b). A biciklusos rendszerek 4 molekulákká történő átalakításához terminális alkéneket használtam az újonnan kidolgozott gyűrűnyitási metatézisek során.

Munkám célja, hogy kifejlesszek egy hatékony és egyszerű módszert a 3 biciklo molekulák preparálására, és tanulmányozzam ezeknek a biciklusoknak a gyűrűnyitási metatézisben várható viselkedését gázhalmazállapotú olefinekkel a 4-es szerkezetek előállításához. A kísérleteket először a ciklizációs reakciók körülményeinek megválasztásával kezdtem tetrabróm-acetont használva (18. ábra, 7. táblázat). A táblázatban feltüntetett hozamok a ciklizációs és a debrómozási részlépés utáni értékek.

Br

18. ábra: Ciklizáció és debrómozás

dién

(ekv.) X katalizátor

(ekv.) hőmérséklet Szonikálás

időtartama termék hozam^a 1a

a feldolgozás után, tisztasága 95%-os (GC-vel)

7. táblázat: Ultrahangos fürdőben kivitelezett ciklizációs reakciók körülményei

Mivel a 2 dibróm intermedier kevésbé stabil, a ciklizáció nyerstermékét a feldolgozás után azonnal redukáltam Cu/Zn katalizátorral (NH₄Cl metanolos oldatában) (Hoffmann et al., 2000).

Montana és munkatársa (2001) az oxiallil vegyület előállításához is Cu/Zn katalizátort használtak, azonban kísérleteim során már –20°C-on megfigyeltem a ciklopentadién (1a) dimerizációját, amely 5°C felett dominánssá vált, így a 3a termék előállítása egyik esetben sem volt kielégítő. Ez arra ösztönzött, hogy Hoffmann és munkatársainak (2000) módszere alapján a kevésbé aktív Zn port használjam. Ezzel a módszerrel nagyon sikeresen ment végbe a reakció, kevesebb mint 5 % ciklopentadién-dimer keletkezett a konverzió során. A reakció ultrahangos fürdőben 1 óra alatt lejátszódott szobahőmérsékleten. A Cu/Zn katalizált debrómozás után a 3a terméket 62%-os hozammal izoláltam. Az ultrahangos fürdőben cinkkel kivitelezett [4+3] cikloaddíciós eljárást sikeresen alkalmaztam 1c és furán (1b) reakciójára. A 3b oxabicikloketont dehalogénezés után, további tisztítás nélkül 50%-os hozammal izoláltam. Ezzel az eljárással a 3b vegyületet meglehetősen egyszerűbben állítottam elő ugyanolyan hozammal mint az

irodalomban fellelhető eredmények. Cu/Zn katalizátorral végzett ciklizációval még jobb eredményeket tudtam elérni furán esetében. A 3b nyerstermék >95%-os tisztasággal jött létre (GC) a debrómozás után, további tisztítás nélkül. Ultrahangos fürdőben Cu/Zn katalizátor használatakor in situ debrómozást is tapasztaltam, pl. a 2b dibróm intermedier nyers keverékének analizálásakor egy kevés dehalogénezett 3b termék is kimutatható volt, amely klasszikus termikus reakcióknál nem figyelhető meg. A 3b termék szintézisénél azt is tapasztaltam, hogy több Cu/Zn használata és a meghosszabbított időtartamú szonikálás nem okozott nagyobb konverziót a kétlépéses folyamat során. Az 1c aktivált pirrolszármazékot is sikerült megfelelő hozammal átalakítani a kívánt 3c aza-bicikloketonná.

Miután kidolgoztam egy egyszerű eljárást biciklusos vegyületek (3) előállítására, ezeknek az előállított molekuláknak a viselkedését vizsgáltam gyűrűnyitási metatézisekben (19. ábra, 8. táblázat). Wright és munkatársai (2001) munkáiban megtalálhatóak a 3 biciklo rendszereken végzett transzformációk, munkámban gázhalmazállapotú olefinekkel végeztem ezeket a reakciókat. Az említett irodalmakból az már kiderült, hogy gyűrűnyitási metatézisekben a gázhalmazállapotú olefinek polimerizáció nélkül használhatóak partnerként.

X O

R X

O

R

19. ábra: A gyűrűnyitási metatézis (a táblázatban található jelölésekhez).

A reakciók során az olefinnel feltöltött ballon a reakcióelegyhez volt csatlakoztatva.

Először az oldószert telítettem az olefinnel, ezután adtam hozzá az elegyhez a katalizátort.

Ha a reakció során az elegyen keresztül buborékoltattam az olefint, az nem okozott konverziónövekedést, ez inkább az etilén oligomerizálódásának kedvezett. A 20. ábrán ballon használatával, illetve állandó buborékoltatással kapott konverziót ábrázoltam az idő függvényében.

(a) kromatográfiás tisztítás utáni hozam; (b) nincs reakció; (c) nem alkalmazható

8. táblázat: Gyűrűnyitási metatézisek eredményeinek összefoglalása

0

20. ábra: Etilén adagolás a reakció során ballonnal [], ill.

állandó buborékoltatással [].

Propilénnel és butilénnel dolgozva egy általános tulajdonságot tapasztaltam. A kettős kötés szubsztitúciója megnövelte az olefinen az elektronsűrűséget, amely a reakcióidő megrövidülését, és magasabb konverzióértéket eredményezett. Grubbs II katalizátor használata gázhalmazállapotú alkén partnerekkel nem vezetett rövidebb reakcióidő eléréséhez. Minden transzformációnál egy egyensúly kialakulását figyeltem meg a biciklo vegyület és a diolefin között. A reakcióknál először mindig Grubbs I katalizátort használtam, azokban az esetekben, amikor nem játszódott le megfelelően a reakció, akkor a Grubbs II katalizátorral is megpróbáltam kivitelezni a reakciót. A gázhalmazállapotú reakciópartnerek használatakor a reakcióképesség az alkén kettős kötésének elektronsűrűségétől függött: a konverziót szignifikánsan fokozni lehetett elektrondonor szubsztituens jelenlétével. Az ilyen reakciók mindegyike 75% feletti konverzióval játszódott le és a termékeket megfelelő hozammal izoláltam. A reakciók végén etil-vinil-étert adtam a reakcióelegyekhez, hogy a feldolgozás során végbemenő gyűrűzáródást minimalizáljam. Az aszimmetrikusan szubsztituált termékeknél különböző E/Z arányok voltak megfigyelhetőek.

A heteroatomot nem tartalmazó biciklusos molekulákon gázhalmazállapotú olefinekkel kivitelezett sikeres reakciók után a heterociklusos biciklo vegyületek 3b és 3c viselkedését tanulmányoztam gyűrűnyitási metatézisekben. A 3b oxigén-tartalmú rendszer hasonlóan viselkedett mint a 3a karbociklusos prekurzor. Az olefinekkel végzett transzformációk a várt termékeket eredményezték. Az egyensúlyi konverziók és az E/Z arányok is hasonlóak a karbociklusos vegyületekéhez. Azonban a 3c metil-karbamát esetében a ROM nem játszódott le gázhalmazállapotú olefinekkel, sem Grubbs I, sem Grubbs II katalizátor jelenlétében. A reakciók során a várt termékek nem képződtek, csak a 3c kiindulási anyagot nyertem vissza mindegyik esetben. Korábban Neipp és munkatársai (2002) is hasonló eredményeket kaptak, amikor a védett nitrogén heteroatomot tartalmazó vegyületekkel próbáltak gyűrűzárási reakciókat végezni.

4.2. Biotranszformációk

Az előállított perhidro-piron molekulák alkalmasnak bizonyultak sejtes biotranszformációkra. A feltételezett (Mihovilovic et al., 2005; Iwaki et al., 2002) két enzimcsoport prototípus enzimei a CHMOAcineto és CPMOComa, a két csoport között átmenetet képező CHMOBreviI-gyel együtt a várt biooxidációs termékeket adták. A táblázatban szereplő eredmények az általam végzett biotranszformációkból származnak (21. ábra, 9. táblázat).

O

21. ábra: Biotranszformációk a táblázatban található jelölésekhez.

Szubsztr. R termék enzim Hozam

9. táblázat: Az elvégzett biotranszformációk eredményei.

A táblázatban feltüntetett szubsztrátumok mellett a laborban dolgozó munkatársaimmal különböző térigényű oldalláncokkal szubsztituált prokirális szubsztrátumokat állítottunk elő a BVMO-k szubsztrátum-hasznosításának tanulmányozása

érdekében. A CHMO-típusú enzimek legfeljebb 3 szénatom hosszúságú oldallánc esetében alakították át a vizsgált molekulákat általában kiváló optikai tisztasággal. Az általam felhasznált biokatalizátorok nagy enantioszelektivitását demonstráltam a divinil szubsztrátum szelektív laktonizálásával is, az olefin funkcióscsoport oxidálása nélkül. A lineárisan 3 szénatom hosszú oldallánc képviseli a határt az enzim aktív centrumának hozzáférését illetően, munkatársaim eredményeiből derült ki, hogy az i-propil vagy annál hosszabb szubsztituenssel már nem, vagy csak alacsony hozammal valósult meg a katalízis. Ezeknél a kísérleteknél a szubsztrátum nagysága meghaladta az enzim által tolerált térbeli nagyságot (Mihovilovic et al., 2008).

A CHMO_Acineto enzim, erős katalitikus képességével és változatos szubsztrátumok átalakításával, a szintetikus kémiában jól alkalmazható. Ezt a tényt igazolva kísérleteimben is mindegyik esetben a CHMO_Acineto eredményezte a legjobb hozam és e.e. értékeket, az ugyanebbe a csoportba tartozó enzimek eredményei minimális eltéréseket mutattak a sztereoszelektivitást illetően. Ezekkel az eredményekkel ellentétben kísérleteim során a CPMO csoport két képviselője - a CPMO_Coma és a CHMO_BreviII – nem alakította át a szubsztituált perhidro-4-piron molekulákat. Hasonló viselkedést tapasztaltam a CHMO_BreviI-nél is, azonban GC-vel a szubsztituált lakton termékeket nyomokban ki lehetett mutatni. Figyelemre méltó kivételt találtam a divinil vegyület átalakítása során, ugyanis azt a CHMOBreviI enzim nagyon jó hozammal és optikai tisztasággal alakította át.

Taschner és Black (1988) az általam előállított biooxidációs termékekhez nagyon hasonló oxepan-2-on karboxil analóggal dolgoztak, aminek kísérletileg meghatározták az abszolút konfigurációját. Feltételezve ugyanazt a konfigurációt a két lakton között, amit az optikai forgatóképesség megegyező előjele is megerősít, és figyelembe véve a Kahn-Ingold-Prelog szabályból eredő prioritásváltozásokat, a heterociklusos termékeimre a (2S, 7R) abszolút konfigurációt adom meg (22. ábra).

O

22. ábra: Taschner és Black (1988) vegyülete és az általam előállított dioxepanon abszolút konfigurációja.

Összegezve a BVMO-kal kivitelezett biotranszformációs kísérleteimet, a biooxidációk kettő sztereogén centrumot hoztak létre és egy enantiomert eredményeztek

nagy optikai tisztasággal mindegyik esetben, amikor az enzimek aktív centrumainak térbeli korlátai lehetővé tették a reakciót. A CHMO- és CPMO- típusú enzimek szignifikánsan eltérő szubsztrátum profilja perhidro-piron szerkezeti egységet tartalmazó heterociklusos ketonok biotranszformációját illetően tovább erősítette a korábbi hipotézist a BVMO-k két különböző enzimcsoportjáról (Mihovilovic et al., 2005; Iwaki et al., 2002). Ezzel a szubsztrátum osztállyal a felhasznált enzimek nem állítottak elő enantiokomplementer lakton termékeket, még a CHMO_BreviII enzim sem eredményezte a + enantiomert, míg a dimetil-ciklohexanonnal vizsgált biotranszformáció során igen (Mihovilovic et al., 2003).

Ez a tény a nagyon polarizált heterociklusos ketonok eltérő fizikai-kémiai tulajdonságainak köszönhető, a korábban tanulmányozott nyilvánvalóan jobban lipofil tulajdonságú karbociklusos szubsztrátumokhoz képest. A heteroatom jelenléte, mint erős elektrondonor központ, okozhatja a BVMO aktív centrumában a szubsztrátum orientációjának megváltozását a heteroatomot nem tartalmazó gyűrűvel rendelkező vegyületekkel ellentétben. Ezért nehéz meghatározni vagy megjósolni a szubsztrátum vagy a Criegee intermedierek pozícióját és konfigurációját, ehhez hozzá járul az is, hogy az általam felhasznált enzimek pontos szerkezetét még nem ismerjük. A kristályosított PAMO enzim áll a legközelebbi rokonságban a CHMO-val, és az elkészített homológia modellből (Bocola et al., 2005) eredő konformációváltozásokat, amelyek a katalízis során végbemennek, a gyakorlatban is igazolni kell. Emellet a CHMO „szuper-szubsztrátum”

modelljének megalkotásán is sokan fáradoznak, hogy a számítógépes modellen alapuló feltételezett enzimszerkezettel összehasonlítva még pontosabb képünk legyen az enzimek működéséről.