2.5.1. A flagellin és a flagelláris filamentum jellemzése
A flagellumok a baktériumok mozgásszervei. A bakteriális flagellum hosszú helikális filamentumai a sejtmembrán felszínén találhatóak és flagellin fehérjék (FliC) több tízezer példányából épülnek fel (Namba et al., 1997). A flagelláris filamentumok önszerveződő rendszerek, azaz megfelelő körülmények között a flagellin monomerek spontán képesek összeállni a natív filemantum szerkezetével megegyező filamentummá. A flagellin alegységek polimerizációja könnyen ellenőrizhető és a képződött filamentumok fizikai, kémiai hatásokkal és proteázokkal szemben ellenállóak, szerkezetét atomi szinten ismerjük (Samatey et al., 2001; Yonekura et al., 2003).
A Salmonella typhimurium baktériumból származó flagellin 494 aminosavból áll.
Különböző baktériumfajokból származó flagellinmolekulák aminosavsorrendjét összevetve nagyfokú homológia állapítható meg a terminális régiók esetében, - amely alatt Salmonella typhimurium esetében kb. 66 aminosavnyi N-terminális és 44 aminosavnyi C-terminális rész értendő -, azonban a fehérjék központi része nagyon variábilis (Wilson et al., 1994).
Különböző eredetű flagellinek molekulatömege tág határok között változik (28-65 kDa), ezek a különbségek a központi rész eltérő méreteiből adódnak.
A flagellin alegységek a sejt belsejében szintetizálódnak és a flagellum-specifikus exportapparátus segítségével jutnak el beépülési helyükre, a filamentum végére (Macnab 2004; Muskotál et al., 2006). A részlegesen kitekeredett monomerek feltételezhetően a flagellum keskeny központi csatornáján (25-30 Å) keresztül szállítódnak. Ismertté vált, hogy a konzerválódott N-terminális 22 aminosav hosszúságú szegmense szükséges ahhoz, hogy a flagelláris exportrendszer felismerje a szállítandó fehérjét (Végh et al., 2006; Gál et al., 2006).
A konzerválódott terminális régióknak is fontos szerepük van a flagellin önszerveződésében (Vonderviszt et al., 1991), hiszen a polimerizálódás során α-helikális kötegekké rendeződve stabilizálódnak és így alkotják a filamentumok központi részét (Mimori-Kiyosue et al., 1997). A flagellin monomerek proteázokkal könnyen emészthetők, pl. tripszinnel is gyorsan megtörténik a rendezetlen terminális régiók eltávolítása és létrejön egy viszonylag stabil 40 kDa-os molekula, amely csak lassan emésztődik tovább egy 27 kDa-os molekulává. A polimerizáció során a rendezetlen terminális régiókból kialakult α-helikális kötegektől erősödik a szerkezet, így a filamentum már ellenálló a tripszinnel szemben is (Vonderviszt et al., 1989).
A flagellin alegységek 11 protofilamentumba rendeződve alkotják a flagelláris filamentumot, amelyben a monomerek erős kölcsönhatásban vannak egymással (15. ábra).
Csak a flagellin alegységek konzerválódott terminális régiói vesznek részt a filamentum felépítésében, a variábilis központi részük a D3 domént alkotja, amely a filamentum felszínén helyezkedik el (16. ábra).
15. ábra: A flagellin alegységek 11 protofilamentumba rendeződve építik fel a flagelláris filamentumok szerkezetét. (Samatey, et al., 2001).
16. ábra: (a) A flagellin alegységek szerkezete. (b) A flagellin alegységek elhelyezkedése a flagelláris filamentumokban. (Yonekura et al., 2003).
(a) D (b)
D
A D3 domén nem lép kölcsönhatásba a szomszédos alegységekkel és nincs lényeges szerepe a filamentáris szerkezetek felépítésében (12. ábra). A D3 domén a génsebészeti eljárások célpontja lehet, mivel könnyen módosítható a flagellin alegységek önszerveződésének és szállítódásának károsodása nélkül.
2.5.2. Flagelláris display-technológiák
Kuwajima (1988) már 1988-ban állított elő olyan E.coli flagellin mutánsokat, amelyeknek variábilis központi részén végeztek deléciókat. A legkisebb deléciós mutáns csupán az N-terminális 193 és a C-terminális 117 aminosavát tartalmazta. Azóta a flagellin központi variábilis régiója jelenti a célpozíciót az idegen eredetű fehérjék génjeinek beillesztéséhez, hogy így azok megjelenhessenek a flagellumok felületén. A flagelláris displayt leggyakrabban az új rekombináns vakcinákkal kapcsolatos kutatásokban használják (Luna et al., 1997), emellett random peptid könyvtárak tesztelésére is alkalmazható, a fág-display technika egyik alternatívájaként. Lu és munkatársai (1995) létrehoztak egy olyan fúziós fehérjét, amelyben az E. coli thioredoxinjának teljes génjét építették be a flagellin gén cserélhető régiójába. Ezaki és munkatársai (Ezaki et al., 1998) szintén E. coli sejtek felszínére juttattak ki eltérő hatékonysággal rekombináns fehérjéket a flagellin gén segítségével. A fúziós fehérjék felszínre jutása az inszert nagyságától és szekvenciabeli helyétől függött, ezeken kívül még számos fel nem derített tényező is áll ennek hátterében.
2.5.3. A flagellin-enzim fúziós fehérjék létrehozása
A flagelláris display esetében demonstrálták, hogy a flagellin variábilis részének nagy fragmentumai eltávolíthatóak és idegen peptideket vagy fehérjéket lehet beültetni erre a helyre úgy, hogy azokat az E. coli vagy a Salmonella baktériumok termeljék (Luna et al., 1997; Lu et al., 1995; Ezaki et al., 1998). Ezeknél az első próbálkozásoknál az eltávolított régiókat véletlenszerűen választották ki nagyfelbontású szerkezeti információk hiányában.
2001-ben viszont sikerült a Salmonella typhimurium flagelláris filamentumának atomi szerkezetét meghatározni (Samatey et al., 2001). Ennek alapján a Salmonella typhimurium flagellinjének egy szerkezetileg független régióját lehet módosítani, amely pontosan a D3 domén, a 190-284. aminosavig terjedő rész. Ezt a régiót kívánom lecserélni monooxigenáz enzimek (CHMO és CPMO) génjeire.
A flagellin-enzim fúziós fehérjék egyik lehetséges nagy előnye az lenne, hogy
különböző filamentáris szerkezetek létrehozására felhasználhatók. A polimerizációs folyamat precíz ellenőrzésével a szükséges méretű filamentumok (0,1µm-20 µm) előállíthatók, amelyek az alegységek ezreit tartalmazzák. Monomer flagellinek oldatában a filamentumképződés elindítható precipitálószerek mint pl. ammónium-szulfát felhasználásával, vagy rövid filamentumok, mint magok, hozzáadásával (Asakura, 1970). Már az egyféle fúziós fehérjéből előállított filamentáris szerkezetek is szolgálhatnak néhány előnnyel: ezeknek a filamentumoknak a felületén nagyon nagy sűrűségben lennének jelen a katalitikus egységek, jellemzően 5 nm-es távolságban egymástól. A filamentáris szerkezetekben az alegységeknek azonos a lokális környezete. Szobahőmérséklethez közeli hőmérsékleten a flagelláris filamentumok hosszú időn át stabilak, és ellenállóak a proteázokkal szemben. Az egyetlen tény, ami veszélyezteti épségüket, az a filamentumok végein található alegységek lassú depolimerizációja, ami alacsony ionerősség mellett következik be. Amennyiben a flagellin-enzim fúziós fehérjék képesek lennének exportálódni és filamentumot formálni a baktérium felületén, ezzel egyidejűleg a felületen enzimek nagy mennyiségben jelennének meg. Ezek a baktériumok, mint új mikrobiális biokatalizátorok hatékonyan alkalmazhatóak lennének biokonverziók esetében. Az ilyen felületek létrehozása egy egyszerű módja a rögzített enzimek előállításának és ez a módszer a gyakorlatban megszüntetné az enzimtisztítás szükségességét.
Az előzőekben említett eljárásnak viszont vannak nyilvánvaló korlátozó tényezői, mint pl. a vizes közeg és a fiziológiai körülmények szükségessége. Ennek az egyfajta enzimet tartalmazó nanoszerkezetnek is több előnye van a már ismert rendszerekhez képest. Segítségével létrehozhatunk például olyan baktériumokat, amelynek a felszínén biokatalízisre képes filamentumok nőnek, és a reakció végeztével ezek a struktúrák könnyen eltávolíthatók, mivel az enzim fúziós fehérjeként vesz részt a flagellumok kialakításában, nem önmagában van jelen a katalízis során. Az ilyen filamentáris multienzim-szerkezetek a következő előnyökkel rendelkeznének a különböző biotechnológiai alkalmazásokban: hordozók nélkül alkalmazhatók, könnyen elválaszthatók a terméktől centrifugálással vagy ultraszűréssel, amely összehasonlítva a manapság használatos biokatalitikus enzimreakciókkal, elegáns és egyszerű megoldást jelentene, és használhatóak olyan körülmények között is, ami az élő sejtekre ártalmas lehet.
A jövőben érdemes lenne továbbfejleszteni a filamentáris enzimszerkezeteket kapcsolt reakciókat katalizáló enzimek használatával, vagy az egyéni enzimeket a kofaktor-regeneráló enzimek együttes alkalmazásával. Ezen az irányvonalon elindulva a molekuláris biológia és biotechnológia modern eszközeivel olyan enantioszelektív és környezetbarát eljárásokat lehet kidolgozni a későbbiekben, amelyek a szerves vegyipari és gyógyszeripari alkalmazások alapját képezhetik.