4. Eredmények és következtetések
4.3. Flagellin-enzim fúziós konstrukciók létrehozása
4.3.1. D3-deléciós flagellin előállítása
A D3-deléciós plazmid előállításához a pKOT-1 plazmidot emésztettem AatII-vel.
Az alábbi gélfényképen (23. ábra) látható, hogy kettő lineáris fragmentumra vágta a plazmidot. Így jött létre a pKOT-1 nagy fragmentuma, amelyet defoszforilálva közvetlenül felhasználtam a későbbi ligáláshoz, és a kis fragmentuma, amelyet a PCR-ekhez használtam fel templátként.
23. ábra: pKOT-1 emésztése AatII restrikciós endonukleázzal 1%-os agaróz gélen. A második zsebben a standard sávjai a következők: 10 kbp, 8 kbp, 6 kbp, 5 kbp, 4 kbp, 3,5
kbp, 3 kbp, 2,5 kbp, 2 kbp, 1,5 kbp, 1 kbp, 750bp, 500 bp, 250 bp.
A PCR eredményeként az alábbi gélen megfuttatott termékek keletkeztek (24.
ábra).
24. ábra: Az 1. zseb: flagellin E-terminálisának (D3 nélküli) tisztítás nélküli PCR terméke, 2. zseb: flagellin C-terminálisának (D3 nélküli) tisztítás nélküli PCR terméke, 3. zseb: az
előző gélen is látható standard.
A PCR termékek gélből történő izolálása és AatII-vel és PmeI-gyel történő emésztése után gélt futtattam a fragmentumokról, így nyertem információt a ligáláshoz szükséges plazmid-inszert arányokról (25. ábra).
25. ábra: A fragmentumok ligálás előtti mennyiségei. 1. zseb: flagellin E-terminálisa, 2.
zseb: flagellin C-terminálisa, 3. zseb: pKOT-1/AatII+SAP nagy fragmentum.
A ligálás utáni transzformálás telepeiből 6-ot kiválasztottam és plazmidot preparáltam belőlük, majd ellenőrző emésztést végeztem. Először PmeI-gyel emésztettem.
Az alábbi gélen látható, hogy a 2., 4. és 5. zsebben lévő plazmid linearizálódott, a 7.
zsebben lévő minta a pKOT-1/PmeI emésztés, amit kontrollnak szántam, hiszen az eredeti pKOT-1-ben nincs PmeI hasítóhely (26. ábra).
26. ábra: A D3-deléciós plazmidok ellenőrzése PmeI-gyel.
A plazmidokat további ellenőrzés érdekében EcoRI-gyel is emésztettem. Az alábbi gélen sorrendben ugyanazok a plazmidok láthatók, mint az előzőn, a 7. zsebben a pKOT-1/EcoRI emésztést, mint kontrollt, melynek kisebb fragmentumának méretéhez viszonyítottam az emésztett DNS-eket. A jó D3-deléciós plazmidban a kisebb EcoRI-es fragmentum 285 bp-ral kisebb kell, hogy legyen mint a pKOT-1- é, hiszen már nincs benne a D3 domén. Az előző gél alapján jónak vélt plazmidokból csupán a 2. plazmid az, ami az EcoRI emésztést követően jó sávot ad, összehasonlítva a 7. zsebben lévő pKOT-1 kontrollal látható az alsó fragmentumok közötti méretkülönbség (27. ábra).
27. ábra: A D3-deléciós plazmidok ellenőrzése EcoRI-gyel (standard ugyanaz mint az előzőekben).
Az emésztéseket követően a 2. zsebben futtatott plazmidot elküldtem szekvenáltatni. Annak érdekében, hogy az egész mutáns flagellin génről információkat nyerjek, négy primerrel szekvenáltattam meg ezt a plazmidot, és bebizonyosodott, hogy valóban egy hibátlan D3-deléciós flagellin plazmid.
Ezt követően került sor a fehérjetermelésre, amihez Salmonella SJW2536 flagellin-deficiens baktériumokat használtam fel. Első megközelítésben arra voltam kíváncsi, hogy a D3-deléciós flagellinből kialakulnak-e filamentumok. Ennek vizsgálatára szolgált a sötétlátóterű mikroszkóp, a motilitás teszt és az SDS gél. Mindegyik vizsgálati módszernél kontroll mintákat is használtam, és azokhoz viszonyítottam a mutáns baktérium viselkedését. Mikroszkópos vizsgálattal megállapítottam, hogy a pozitív kontrollhoz képest (pKOT-1-gyel elektroporált SJW2536) a D3-deléciós flagellinnel rendelkező baktériumok meglehetősen jól úsztak D3 domén nélkül is, mozgásuk hasonló volt. A negatív kontroll, az SJW2536 baktériumok egy kicsit mocorogtak, pörögtek, de nem úsztak. A motilitás teszttel számszerűsíthetők az eredmények, és így jobban összehasonlíthatók, ugyanis az overnight növesztett telepek a híg motilitás agaron a baktériumok mozgásképességétől függően különböző nagyságúak. Mindegyik baktériumnál 3 párhuzamos telepet vizsgálva a következő eredményeket kaptam (10. táblázat):
Plazmid/baktérium Telepek átmérői (cm) Átmérők átlaga (cm)
pKOT-1/SJW2536 2,6 2,7 2,7 2,67
D3-deléciós/SJW2536 1,7 1,7 1,8 1,73
-/SJW2536 0,3 0,3 0,3 0,3
10. táblázat: Motilitás teszt eredményei.
A Kísérleti rész 3.9.3.1. pontjában leírt módon készítettem az SDS gélre a mintákat annak érdekében, hogy csak a baktériumok felszínén található fehérjékről, a filamentum létezéséről kapjak információt. Az alábbi gél alapján is elmondható, hogy a baktérium a D3-deléciós plazmidból ugyanolyan mennyiségben termeli a mutáns flagellint mint az eredeti pKOT-1-ből (28. ábra). A korábbi feltevésemet igazolva valóban nem zavarja a D3 domén hiánya a baktériumot a filamentumképzésben sem.
28. ábra: D3-deléciós (42 kDa) és vad flagellin (51kDa) minták hőkezelt töményített felülúszókból, standard sávjai: 66 kDa, 45 kDa, 36 kDa.
Ezeket a vizsgálatokat követően párhuzamosan végeztem a vad Salmonella typhimurium flagellinjének preparálását nagy mennyiségben a D3-deléciós flagellinnel, az irodalomban fellelhető módszer alapján (Vonderviszt et al., 1989). Összehasonlítható mennyiségben sikerült termeltetnem a vad és mutáns fehérjéket, 2 liter tápoldatból vad flagellin esetében 51,4 mg-ot, míg a D3-deléciós mutánsból 58,9 mg-ot preparáltam azonos körülmények mellett. Ami még látványosabb volt a preparálás során, az a helikális filamentumkötegek mikroszkópos képe, amelyek méret és milyenség alapján nagyon hasonlóak (29. ábra).
a, b,
29. ábra: a, vad; b, D3-deléciós helikális kötegek (baktériumokkal) a preparáláskor.
A preparálás során a tisztítást a flagellinek későbbi vizsgálataihoz háromszor ismételt monomerizáció-polimerizáció egymás utáni kivitelezésével valósítottam meg. A következő gélen látható (30. ábra), hogy megfelelően tiszta fehérjemintákat lehet előállítani ezzel a módszerrel.
30. ábra: 1. zseb: D3-deléciós flagellin 2. polimerizálás előtt, 2. zseb: 3. polimerizálás előtt, 3. zseb: 3. polimerizáció után. 4-6. zseb: vad flagellin minták esetében ugyanaz mint
a D3-deléciós mintáknál.
A D3-deléciós fehérje emésztési térképét vizsgáltam tripszinnel filamentum és monomer formában is, összehasonlítva a vad fehérje viselkedésével. A 31. ábrán megfigyelhető, hogy filamentum formában egyik esetben sem volt emésztődés tripszinnel,
még 3 hét elteltével sem, ami a rendezetlen terminális régiók filamentumképződés során végbemenő stabilizálódásának tudható be. Ezeket a tripszines vizsgálatokat párhuzamosan végeztem a monomer flagellinével ugyanabból a tripszin törzsoldatból dolgozva.
a, b,
31. ábra: Filamentumok emésztése tripszinnel, mintavételek különböző időpontokban;
a, vad minták: 0 perc (’), 5’, 10’, 20’, 60’, 90’, 3 hét;
b, D3-deléciós minták: 0’, 5’, 10’, 20’, 60’, 90’, 3 hét.
A monomer formában történt D3-deléciós mutáns emésztése során megfigyeltem, hogy hasonló emésztési sávokkal jellemezhető mint a vad flagellin, figyelembe véve azt a különbséget, hogy a mutáns fehérje D3 domént nem tartalmaz (32. ábra).
a, b,
32. ábra: Monomerek emésztése tripszinnel, mintavételek különböző időpontokban, az 1.
zsebekben használt standard: 66 kDa, 45 kDa, 36 kDa, 29 kDa, 24 kDa;
a, vad minták: 0’, 1’, 5’, 10’, 30’, 120’,240’, 20 h, 2 nap;
b, D3-deléciós minták: 0’, 1’, 5’, 10’, 30’, 120’, 240’, 20 h.
A mutáns flagellin esetében is először a rendezetlen terminális régiók emésztődnek el gyorsan. A D3-deléciós és a vad monomer esetében is egyformán kb. 10 percre volt
szüksége a tripszinnek, hogy a rendezetlen terminális régiókat eltávolítsa. Ezután míg a vad flagellin esetében egy kb. 40 kDa-os fragmentum marad vissza, addig a D3-deléciós esetében kb. 31 kDa molekulatömegű, melyek már sokkal lassabban emésztődnek el. A mutáns esetében a viszonylag stabil 31 kDa-os fragmentumot kb. 110 perc alatt emészti el a tripszin.
A CD mérések görbéit (33. ábra) kiértékelve, a kapott inflexiós pontok adják meg a fehérjék olvadáspontját. Ezek alapján az olvadáspontok a következő értékeknek adódtak:
D3-deléciós filamentum: 52,32 ± 0,05 °C Vad filamentum: 54,16 ± 0,04 °C D3-deléciós flagellin 39,7 ± 0,18 °C Vad flagellin 47,44 ±0,13 °C
33. ábra: CD mérések (Pme2: D3-deléciós flagellin).
Az előállított D3-deléciós filamentum olvadáspontja 2 °C-kal alacsonyabbnak adódott, mint a vad filamentum esetében. Tehát a mutáns flagellinekből felépülő polimer stabilitása kis mértékben eltér az eredetitől. A különbség kis mértéke magyarázható azzal a ténnyel, hogy a monomerként rendezetlen terminális régiók α-helikális kötegekké összeállva stabilizálják a filamentum szerkezetét, és a deléciós konstrukció kialakítása során azokat nem módosítottam. A filamentum stabilitásáról kapott eredmény megerősít abban, hogy a D3 domén helyére tervezett linkert a célkitűzésnek megfelelően terveztem meg.
Monomerek esetében viszont ez a különbség jóval nagyobbnak adódott, ami várható volt, hiszen a flagellinek esetében a terminális régiók rendezetlenek, és csak a flagellin középső részének van meghatározott stabil szerkezete. Mivel a flagellin közepéről távolítottam el a D3 domént (kb. 9 kDa), így míg a rendezetlen régiók változatlanul megmaradtak, addig a szerkezettel rendelkező részek mennyisége lecsökkent. Ez szemléletesen érzékelhető a korábban bemutatott D3-deléciós flagellin tripszines emésztéséből (28. ábra), hiszen a tripszinnek sokkal kevesebb idő kellett a mutáns monomer teljes elemésztéséhez a vadhoz képest azt is figyelembe véve, hogy a rendezetlen régiókat ugyanannyi idő alatt távolította el mindkét fehérje esetében.
4.3.2. Flagellin-enzim DS konstrukciók létrehozása
A CHMO és CPMO gének PCR-ezése után előkészítettem a fragmentumokat és a D3-deléciós plazmidot a ligáláshoz. A DNS-eket emésztettem PmeI-gyel, a plazmidot defoszforiláltam. Az alábbi (34. ábra) gélen látható a ligálás előtti állapot, a plazmid-inszert arányok vizsgálatához.
34. ábra: Ligálás előtt; 1. zseb: D3-deléciós plazmid/PmeI+SAP, 2. zseb: CPMO inszert, 3. zseb: CHMO inszert, 4. zseb: standard (10 kbp, 8 kbp, 6 kbp, 5 kbp, 4 kbp, 3,5 kbp, 3
kbp, 2,5 kbp, 2 kbp, 1,5 kbp, 1 kbp, 750bp, 500 bp, 250 bp).
Mindegyik ligálásból 5-5 telepem nőtt fel, ezekből preparáltam plazmidot és emésztéssel ellenőriztem a ligálás sikerességét. Először PmeI-gyel emésztettem, így lett látható, hogy az inszert valóban beépült-e a D3-deléciós plazmidba, kontrollként az üres D3-deléciós plazmidot használtam (35. ábra).
35. ábra: 1-5. zseb: D3-deléciós-CHMO plazmidok, 6. zseb: D3-deléciós plazmid/PmeI, 7-11. zseb: D3-deléciós-CPMO plazmidok
Ez alapján megállapítható, hogy a CHMO plazmidok közül a 3., 4. és 5.
plazmidban volt benne az inszert, a CPMO plazmidok közül pedig az 1., 2., 3. és 5.
plazmidokban. Ezután csak a jónak vélt plazmidokkal végeztem el az orientációellenőrzést.
A korábban leírtak (3.9.2.2. fejezetben) alapján a HindIII restrikciós enzim mindkét konstrukcióhoz megfelelőnek bizonyult az orientációellenőrzéshez. A CHMO esetében, ha a kisebb fragmentum 240 bp-ral kisebb, akkor van jó orientációban a gén a plazmidban. A CPMO esetében pedig 1540 bp-ral nagyobb a kisebb fragmentum jó orientáció esetén (36.
ábra). Ezeknek a méreteknek természetesen csak egymáshoz viszonyítva van értelmük.
36. ábra: Orientációellenőrzés HindIII-mal: 1-3. zseb: CHMO konstrukciók, 4. zseb: D3-deléciós plazmid, 5-8. zseb: CPMO konstrukciók.
Ezek alapján az előző gélen az 1. zsebben futott D3-deléciós-CHMO plazmidot és a 6.
zsebben lévő D3-deléciós-CPMO plazmidot mondhatom sikeres fúziós plazmidoknak.
Viszont annak érdekében, hogy pontosabb információt kapjak a plazmidok hibátlanságáról, szekvenáltatás is szükséges. Jelenleg a szekvenáltatás és a fehérjék termeltetése folyamatban van.
Összefoglalás
Kifejlesztettem egy kényelmes és egyszerű módszert karbo- és heterociklusos biciklo [3,2,1] oktanonok előállítására ultrahangos fürdő segítségével. Ehhez a eljáráshoz csak aktivált cinket, rezet és kereskedelmi forgalomban kapható vegyszereket használtam.
Ezzel a kétlépéses folyamattal bonyolult feldolgozás nélkül állítottam elő nehezen preparálható 3a, 3b, 3c ketonokat a preparatív kémiában felhasználható hozammal. Ezzel a módszerrel akár grammnyi mennyiségeket is elő lehet állítani. Ezután a gyors, egyszerű módszer után, amellyel a híd-típusú biciklusokat előállítottam, kifejlesztettem egy diasztereoszelektív reakcióutat, amelyet a difunkcionált hattagú cikloketonok (4a, 4b, 4c, 4f, 4g, 4h) előállítására alkalmaztam. Ez az eljárás a gyűrűnyitási metatézis, amelyet gázhalmazállapotú olefinek közreműködésével végeztem. A gyűrűnyitási reakció az enantioszelektív Baeyer-Villiger oxidáció tanulmányozásához szükséges prekurzorok előállítása miatt volt fontos a munkám során.
Kísérleteim során megállapítottam, hogy az előállított perhidro-piron molekulák alkalmasak a sejtes biotranszformációk vizsgálatára, a biooxidációk során a várt termékek keletkeztek. A CHMO-típusú enzimek aktív centrumainak hozzáférését illetően a vizsgált három szénatom hosszúságú oldallánc képviselte a határt, hosszabb szubsztituensek esetében nem játszódott le a katalízis. A perhidro-piron-típusú molekulákkal végzett kísérleteimben a CHMOAcineto eredményezte a legjobb hozam és e.e. értékeket. Figyelemre méltó, hogy a divinil vegyület biotranszformációja során a CHMOBreviI enzimmel értem el a legjobb hozamot kiváló optikai tisztasággal. Az irodalomban fellelhető hasonló szerkezetű molekulák eredményeit felhasználva, és a prioritásváltozásokat figyelembe véve megállapítottam a heterociklusos termékeimre a (2S, 7R) abszolút konfigurációt. A szekvenciahomológia és a katalizált reakciók alapján korábban feltett hipotézist kísérleteimmel igazoltam, miszerint az általam is felhasznált BVMO-kat 2 csoportba lehet osztani. A CHMO csoportba tartoznak a CHMOAcineto, CHMORhodoI, CHMORhodoII, CHMOAcido, CHMOArthro enzimek. A CPMO csoportba pedig a CPMOComa és CHMOBreviII
enzimek tartoznak. Eredményeim alapján azt is bizonyítottam, hogy a CHMOBreviI enzim egyik csoportba sem sorolható, egy extrém esetet képvisel, átmenetet képezve a különböző biokatalitikus viselkedésformák között.
A flagellin-enzim fúziós konstrukciók létrehozásának érdekében először a D3-deléciós flagellin mutánst állítottam elő, hiszen az eltávolított D3 domén helyére kívántam beépíteni a CHMO és CPMO enzimeket. A létrehozott D3-deléciós plazmid fehérjetermelési tulajdonságait meghatároztam. A mutáns baktériumok a vadhoz képest
kissé elmaradó úszási képességét sötétlátóterű mikroszkóppal és motilitás teszttel vizsgáltam. Elmondható, hogy a mutáns flagellint ugyanolyan mennyiségben termeli a Salmonella baktérium mint az eredeti vad flagellint, és a preparálás során kialakult helikális kötegek mikroszkópos képe nagyon hasonló. A termeltetett D3-deléciós fehérjét polimer és monomer formában jellemeztem tripszines emésztési vizsgálatokkal és CD-vel meghatározott olvadáspontokkal. Ezt követően előállítottam a flagellin-CHMO és flagellin-CPMO DNS-konstrukciókat.