Flagellin-enzim fúziós fehérjék létrehozása

3.9.1. DS konstrukciók tervezése

A Salmonella typhimurium flagellinjének (FliC) egy szerkezetileg független régióját, a D3 domént (191-284. aminosavig terjedő rész) kívánom lecserélni monooxigenáz enzimek (CHMOAcineto és CPMOComa) génjeire. Első lépésként a D3-deléciós mutánst állítottam elő úgy, hogy a teljes D3 domént eltávolítottam a fliC génből, és helyére egy rövid oligonukleotid szakaszt (linkert) illesztettem be. A linker tervezésekor figyelembe kellett vennem, hogy olyan aminosavakat kódoló nukleotidokkal alakítsak ki vágóhelyet a pKOT-1 plazmidban, amelyek a flagellin szerkezetét valószínűleg nem, vagy csak kis mértékben változtatják meg és emellett olyan restrikciós endonukleázt kellett választanom, ami nem hasítja az eredeti pKOT-1 plazmidot. Így esett a választás a PmeI enzimre. Tehát a D3 domén helyére beépített linker a következő aminosavakat tartalmazta a 190. és a 285. aminosavat is beleértve: GGLNSAA. A glicin kis méretéből adódóan lehetőséget biztosít a peptidlánc flexibilitására, a leucin és az alanin hidrofóbok lévén erősítik a kompakt szerkezetet, α-hélix kedvelő aminosavak. Az aszparagin adott aminosav volt a PmeI vágóhelyet kódoló nukleotidok miatt, a szerinnel együtt poláros aminosavak.

Az előzőek alapján megtervezett és előállított D3-deléciós konstrukciót a soron következő kísérletekben használtam fel, mint a heterogén DNS szekvencia alapját. Azokat a flagellin szekvenciarégiókat, amelyek szükségesek és elégségesek a flagellinfehérjék célbajuttatásához, a filamentumok végéhez való transzportálásához, nem módosítottam. Ez remélhetőleg azt eredményezi, hogy a rekombináns flagellin molekula - mivel megmarad az a képessége, hogy a sejt felszínén kifejeződjön - mint a flagelláris filamentumot felépítő alegység - könnyen izolálható és tisztítható lesz.

A 17. ábrán részletesen láthatóak DNS-szinten a D3-deléciós illetve a fúziós konstrukciók kivitelezésének részlépései. A flagellin fehérje promóterét és génjét tartalmazó pKOT-1 plazmidból először AatII enzimmel kivágtam a flagellin génjét, az előtte lévő génszabályozó szakasszal, a promóterrel együtt, ezt jelzi az ábrán az AatII restrikciós endonukleáz vágóhelyei közötti kisebb fragmentum. Ezen a lineáris DNS-szakaszon végeztem a későbbiekben a változtatásokat annak érdekében, hogy a flagellinből a D3 domén génszakaszát el tudjam távolítani. Polimeráz láncreakció (PCR) segítségével PmeI restrikciós vágóhelyet építettem be a D3-deléciós flagellin mutánsba, aminek segítségével lehet bejuttatni a mutáns flagellin génbe a fúzionáltatni kívánt enzim génjét.

Ezután a D3 nélküli (deléciós) flagellin DNS-szakaszt visszaépítettem az üres plazmidba,

így létrejött a D3-deléciós flagellin mutánst tartalmazó plazmid, amely a későbbiekben használható volt arra, hogy a PmeI restrikciós vágóhelyre, a D3 domén helyére beültessek monooxigenáz enzimet. Ehhez az kellett, hogy a monooxigenázok génjét tartalmazó plazmid segítségével úgy sokszorozzam meg a CHMO és CPMO génjét PCR-rel, hogy annak a két végén PmeI restrikciós vágóhelyek legyenek. A monooxigenáz gének beültetését úgy végeztem el, hogy PmeI restrikciós enzimmel emésztettem a megsokszorozott monooxigenáz géneket és a létrehozott mutáns flagellint tartalmazó plazmidot, majd összekeverve ezt a két komponenst, ligáz enzim segítségével, összeépítettem.

17. ábra: A flagellin-enzim fúziós DES-konstrukció létrehozásának részlépései.

A rekombináns plazmidokat elektroporálással juttattam be a fehérje termeltetésére használandó SJW2536-os flagellin-deficiens baktériumokba. Vizsgáltam, hogy a fúziós fehérjék exportálódnak-e a flagelláris exportrendszeren keresztül, és filamentumot formálnak-e a baktérium felszínén, vagy a citoplazmában akkumulálódnak. Ennek megállapítására sötétlátóterű mikroszkóp, motilitás teszt és SDS gélelektroforézis szükséges.

Ha a fúziós fehérjék a flagelláris exportrendszer segítségével szállítódva flagelláris filamentumokat hoznak létre, akkor könnyedén leválaszthatóak a sejtről mechanikus erő hatására, centrifugálással izolálhatók és hő hatására monomerizálhatók. Remélhetőleg a fúziós fehérjék polimerizációs képessége lehetővé teszi a könnyű tisztítást a polimerizáció és depolimerizáció egymás utáni többszöri kivitelezésével. A tisztított flagzimek feltekeredését kalorimetriai és spektroszkópiai mérésekkel lehet ellenőrizni, a katalitikus aktivitást pedig standard enzimvizsgálatokkal.

3.9.2. DS konstrukciók előállítása

3.9.2.1. D3-deléciós plazmid

A DNS munkát a pKOT-1 plazmid AatII restrikciós endonukleázzal történő emésztésével kezdtem (későbbiekben jelölése: pKOT-1/AatII). Ennek az enzimnek kettő vágóhelye van ezen a plazmidon, így azt kettő lineáris fragmentumra vágja (2kb és 5kb). A kisebbik fragmentum tartalmazza a flagellin promóterét és génjét, ami templátként szolgál a PCR reakcióhoz. Az AatII-es emésztési elegyet 37 ̊C-on 1,5 órán keresztül inkubáltam, majd 65 ̊C-on 20 percig inaktiváltam az enzimet, ezután gélből izoláltam mindkettő fragmentumot.

A kisebb fragmentum felhasználását az előzőekben említettem. Az 5kb-os fragmentumot előkészítettem a későbbi ligáláshoz, hiszen az AatII vágóhelyeken illesztem vissza a módosított flagellint. A plazmidot először defoszforiláltam SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) enzimmel, mely a DNS 5’ végén lévő foszfátcsoportot távolítja el, ennek következtében a fragmentum két vége nem tud kialakítani foszfodiészter kötést egymással, így meg lehet akadályozni, hogy a későbbi ligálás során ez a DNS önmagába kapcsolódjon össze. A defoszforilálás reakcióelegyét 37 ̊C-on 30 percen keresztül inkubáltam. Ezután 65 ̊C-on 15 percig inaktiváltam az enzimet, majd Wizard oszlopon tisztítottam, és 35 µl steril deszt. vízzel eluáltam.

PCR reakcióval hoztam létre a D3-deléciós inszertet négy primer segítségével. A flagellin N-terminálisának (az első AatII helytől, ami a promóterben van) PCR-ezésére használtam a Del1AatIIfor (5’-CCACCTGACGTCTAAGAAACCATT- 3’) primert, amely az AatII helyet tartalmazta és a Del1PmeIrev (5’-AGAGTTTAAACCTCCTGTAACAGTTGCAGCCGTATCG- 3’) primert, ami a PmeI helyet. A C-terminális (a második AatII vágóhelyig, ami a FliC gén utáni terminátor régióban van) felerősítésére a Del1PmeIfor (5’- TAT GGT_Ala TTA_Leu AAC_Asn TCT_Ser GCA_Ala GCA_Ala AATGCTGATTTGACAGAGG-3’) primert (alsó indexben a inzercióban kódolt aminosavakat tüntettem fel), amely a PmeI helyet tartalmazta és a Del1AatII2rev (5’-CCACCTGACGTCACCTCCGGGC-3’) primert az AatII vágóhellyel. A reakció templátjaként a pKOT-1 plazmid AatII-vel történő emésztéséből izolált kisebb fragmentum szolgált, amelyből úgy sokszoroztam meg az előbb említett primerekkel a flagellin elejét és végét, hogy a középső részét, a D3 domént nem tartalmazta. A flagellin N-terminálisának (Del1AatIIfor és Del1PmeIrev primerekkel) és C-terminálisának (Del1PmeIfor és Del1AatII2rev primerekkel) PCR-ezését a következő összeméréssel és programmal kiviteleztem: előkészítésének érdekében. Az emésztési elegyet (egyszerre mindkét enzimmel) 37 °C-on 1 órán keresztül inkubáltam, majd 65 °C-on 20 percig inaktiváltam az enzimeket. Ezt követően az emésztett DNS-t Wizard oszlopon tisztítottam és 35 µl steril deszt. vízzel eluáltam. Az így előkészített fragmentumokat ligáltam össze egymással és a pKOT-1 plazmid AatII enzimmel emésztett nagy fragmentumával. A ligálás előtt agaróz gélen megfuttattam a DNS mintákat, hogy megtudjam mennyi az egymáshoz viszonyított mennyiségük, milyen összeméréssel kivitelezzem a ligálást. Ez alapján a ligálási elegyhez a következő mennyiségben mértem össze az összetevőket: 1 µl 60 ng/µl flagellin N-terminális PCR termék, 1 µl 50 ng/µl flagellin C-N-terminális PCR termék, 1 µl 20 ng/µl

pKOT-1/AatII nagy fragmentum, 2 µl 5x ligáz puffer, 4 µl Steril deszt. víz, 1 µl ligáz. A ligálási reakciót 22 °C-on 10 percen keresztül inkubáltam, majd jégre tettem és a 10 µl ligálási eleggyel transzformáltam 200 µl E.coli TOP10 kompetens sejtet. A sejteket ampicillin tartalmú LB (LB_Amp) táptalajra kikentem és 20 órán keresztül növesztettem 37

°C-on. A felnőtt telepeket leoltottam 4-4 ml folyékony LBAmp-ba és felnövesztés után (37

°C overnight) ezekből a baktériumkultúrákból plazmidot preparáltam. A rekombináns plazmidok ellenőrzését PmeI és EcoRI enzimeket használva végeztem el, az emésztett mintákat 1%-os agaróz gélen futtattam. A PmeI-es emésztés annak a megállapítására szolgált, hogy a módosított plazmid valóban tartalmazta-e a beépített PmeI vágóhelyet. Az EcoRI-es emésztésnek pedig az eredeti pKOT-1 kontrollhoz viszonyított méretcsökkenést kellett mutatnia, mivel a plazmidból kivágott inszertnek a D3 méretével (285 bp) kisebbnek kellett lennie. Így választottam ki azokat a D3-deléciós plazmidokat, amelyeket további ellenőrzés érdekében elküldtem szekvenáltatni.

Az így előállított D3-deléciós flagellint tartalmazó pKOT-1 plazmidot használtam a flagellin-CHMO és flagellin-CPMO DNS konstrukciók létrehozására a beépített PmeI restrikciós endonukleáz vágóhely segítségével.

3.9.2.2. Fúziós DS konstrukciók

Először a D3-deléciós plazmidba beépíteni kívánt CHMO_Acineto és CPMO_Coma gént sokszoroztam meg PCR segítségével. Ehhez templátként a pDR01 és pDR05 plazmidokat használtam fel, melyeket a biotranszformációk során is alkalmaztam transzformált E.coli sejtek felhasználásával. Első körben a PCR-hez primereket kellett tervezni. A CHMO génhez (1620 bp) a CHMOPmeIforw (5’- AGAAGTTTAAACATACATATGTCACAAAAAATGGA -3’) és CHMOPmeIrev (5’- TATGGTTTAAACCTTGCTTGATATCTGAACGTTGT -3’) primereket, a CPMO

génhez (1650 bp) pedig a CPMOPmeIforw (5’-

ACAAGTTTAAACATACATATGACCACCATGACCAC -3’) és CPMOPmeI rev (5’- TCAAGTTTAAACGCGAGAAGCCTGCATATCCT -3’) primereket alkalmaztam, melyek tartalmazták a PmeI restrikciós hasítóhelyet is. CHMOAcineto génhez a következő összemérést és programot használtam a PCR során:

25 µl steril deszt. víz 5 µl 10x KOD puffer 3 µl 25 mM MgSO4

5 µl 2 mM dNTP

5 µl 10 pmol/ µl CHMO PmeIforw primer 5 µl 10 pmol/ µl CHMO PmeIrev primer

A CPMO_Coma PCR-ezéséhez az alábbiakat:

25 µl steril deszt. víz 5 µl 10x KOD puffer 3 µl 25 mM MgSO₄ 5 µl 2 mM dNTP

5 µl 10 pmol/ µl CPMO PmeIforw primer 5 µl 10 pmol/ µl CPMO PmeIrev primer egyszerre 4 adag PCR-t, a CHMO esetében pedig 8 adaggal, mert jóval kevesebb terméket kaptam a reakció során. Az DNS-eket az oszlopról 45 µl steril deszt. vízzel eluáltam, majd emésztettem PmeI-gyel. Ezzel egyidejűleg a D3-deléciós pKOT-1 plazmidot is előkészítettem a ligáláshoz, emésztettem PmeI enzimmel, majd defoszforiláltam SAP enzimmel. A standard ligálási protokoll alapján ligáltam össze a D3-deléciós plazmidot a CHMO-val és a CPMO-val. Az összemérés a következő volt: 2 µl 12 ng/µl D3-deléciós plazmid/PmeI+SAP, 3 µl 80 ng/µl CHMO/PmeI, 4 µl 5x ligáz puffer, 10 µl steril deszt. víz, 1 µl ligáz. Az összemérés CPMO inszerttel is hasonló volt. A ligálási elegyekkel (10-10 µl-rel) E.coli TOP10 kompetens sejteket transzformáltam. A felnőtt telepeket leoltottam 4-4 ml folyékony LB_Amp tápoldatba, ezekből a kultúrákból preparáltam plazmidot. A ligálás eredményességét először PmeI enzimes emésztéssel ellenőriztem, hiszen így 2 lineáris fragmentumra kellett bontania a plazmidomat, a nagyobb az inszert nélküli D3-deléciós plazmid, a kisebb a CHMO vagy a CPMO génje. Ezt követően orientációellenőrzés érdekében HindIII-as emésztést is végeztem azokkal a plazmidokkal, amelyekben valóban benne volt az inszert. Az orientációellenőrzésre azért volt szükség, mert csak 1 restrikciós

endonukleázt, a PmeI-t használtam fel a fúziós konstrukciók létrehozására, így az inszertek fordítva is beépülhettek a D3-deléciós plazmidba. Azért a HindIII enzimet választottam erre a célra, mert a pKOT-1 plazmidban csak 1 vágóhelye van, valamint az enzimek génjeiben is van 1- 1. Tehát szintén 2 lineáris fragmentumot kellett kapnom, melyek a jó orientációjú CHMO-s konstrukció esetében: 6072 bp és 1480 bp méretűek. Ha a CHMO fordítva épült be, akkor 5802 bp és 1750 bp nagyságúra változnak a fragmentumok. A CPMO-s konstrukció esetében jó irányú beépüléssel: 5184 bp és 2389 bp-os DNS-eket, míg rossz orientáció esetében: 6711 bp és 862 bp nagyságú lineáris fragmentumokat kell kapni a HindIII-as emésztés után. Ezek a méretbeli különbségek jól ellenőrizhetők agaróz gélen.

3.9.3. D3-deléciós flagellin fehérje

3.9.3.1. Fehérjetermeltetés

Szekvenáltatás után a hibátlan D3-deléciós plazmidot elektroporáltam Salmonella SJW2536-os elektrokompetens sejtekbe. Ez a Salmonella egy flagellin-deficiens baktérium. Ennek a baktériumnak csak a flagellin génjét távolították el, minden más génje megmaradt, így ha egy olyan plazmidot juttatok bele, amely flagellint kódol, akkor a flagellinek az exportcsatornán átjutva a baktérium felszínén filamentumot hoznak létre és így a nem úszó deficiens baktériumból úszó baktérium lesz. A transzformált baktériumok úszóképességét sötétlátóterű mikroszkóppal, motilitás teszttel és közvetetten SDS gélelektroforézissel vizsgáltam. Ezekhez a vizsgálatokhoz kontroll baktériumokat használtam, melyekhez hasonlítottam a D3-deléciós flagellinnel rendelkező baktérium viselkedését. A pozitív kontroll a pKOT-1-gyel elektroporált SJW2536-os baktériumkultúra, a negatív kontrollt pedig a plazmidot nem tartalmazó SJW2536-os baktériumkultúra jelentette.

Sötétlátóterű mikroszkóp használatával tudtam összehasonlítani a baktériumok úszását, illetve a preparálás során a kialakult filamentáris kötegek milyenségét. A motilitás agarra oltott baktériumokat 37 °C-on növesztettem egy éjszakán keresztül, majd lemértem a felnőtt telepek nagyságát. A motilitás teszthez felhasznált baktériumkultúrát úgy állítottam elő, hogy 37 °C-on egy éjszakán keresztül tápoldatban felnövesztettem azt a kultúrát, amiből 10 µl-t oltottam be 4 ml LB-be és ezt növesztettem egészen addig, míg 600 nm-en az abszorbanciája 0,6 körüli érték lett. A vizsgálni kívánt baktériumokat azonos abszorbanciaértékig növesztettem, hogy a motilitás teszt eredménye valóban összehasonlítható legyen. Az SDS gélt a következő mintaelőkészítés után használtam

annak érdekében, hogy megállapítsam, hogy a baktériumok valóban létrehoznak-e filamentumot a baktériumok felszínén a D3-deléciós flagellinből. 1 ml overnight baktériumkultúrát 60 °C-on 10 percig melegítettem, majd 13 000 rpm-mel 10 percen keresztül centrifugáltam a sejteket. Így az ülepítés után a felülúszóban csak azok a monomer flagellinek voltak, amelyek a sejt felszínén kialakították a filamentumot. Az SDS gélre való felvitel előtt ezeket a felülúszókat töményítettem 1 ml-ről kb. 100 µl-re, és ennek 20 µl-éhez adtam 10 µl mintapuffert és ebből 10 µl-t vittem fel a 12,5%-os gélre.

A fehérjetisztítást háromszori depolimerizációs-polimerizációs lépéssel valósítottam meg 3 M ammónium-szulfát oldatot használva, amit 0,8 M végkoncentrációban adagoltam a fehérjeoldatomhoz mindig azonos fehérjekoncentráció mellett, majd szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül inkubáltam. A képződött filamentumokat 40 000 rpm-en 1 órán keresztül centrifugáltam, a filamentumcsapadékot +4 on tároltam. A monomerizálást 10 perc 70 °C-on történő inkubálással valósítottam meg, amelyet 40 000 rpm-en 1 órás centrifugálás követett, így lehetséges a fehérje mellett lévő szennyezők eltávolítása, hiszen a monomer flagellin a felülúszóban marad.

3.9.3.2. A D3-deléciós flagellin emésztési vizsgálata tripszinnel

Párhuzamosan végeztem a vad flagellin és a D3-deléciós flagellin emésztését.

A filamentum és a monomer formában lévő minták koncentrációja 0,9 mg/ml-es volt, 20mM foszfát, 150 mM NaCl pH 7,0 puffer használatával. A mintákhoz 300:1 (fehérje:tripszin) tömegarányban adtam a tripszint. Meghatározott időközönként mintát vettem az emésztésekből analízis céljából. 20 µl tripszines mintához 10 µl mintapuffert adtam és 95 °C-on 3 percig melegítettem, így állítottam le az emésztést. Ezekből a mintákból futtattam 10 µl-t 12,5%-os SDS gélen.

3.9.3.3. Denaturációs hőmérséklet meghatározása CD-vel

A vad és D3-deléciós flagellin mintákat ugyanolyan körülmények között háromszori polimerizáltatással tisztítottam. A CD mérés előtt az 1 mg/ml-es flagellinoldatokat 0,8 M végkoncentrációjú szilárd ammónium-szulfáthoz pipettáztam, majd szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül polimerizáltattam. A filamentumcsapadékot háromszor mostam 20mM foszfát, 150 mM NaCl pH 7,0 pufferben (a mosással távolítottam el a maradék ammónium-szulfátot teljesen a csapadékból), a hígításhoz is ezt a puffert használtam. A mérések során 0,1 mg/ml koncentrációjú fehérjeoldatokat vizsgáltam 1 cm-es küvettában, 20-70 ̊C-ig fűtöttem (100 ̊C/óra) és 222 nm-en detektáltam.