Felhasznált anyagok és módszerek

A munkám során felhasznált szerves oldószereket használat előtt desztilláltam. Az ultrahangos reakciók során Bandelin Sonorex super RK102H ultrahangos fürdőt használtam. A termékek tisztítását szilikagél 60 (40-63 µm, Merck) töltettel kiviteleztem.

A GC vizsgálatok ThermoQuest Trace GC 2000 készülékkel készültek, DB5 (30 mm x 0.32 mm ID) és BGB 175 (30 mm x0,25 mm ID, 0,25 µm film) oszlopokkal. Az enantiomer felesleget (e.e.) a királis oszlopon végzett GC adatokból határoztam meg. Az NMR spektrumok felvétele CDCl3 oldószerben, Me4Si belső standarddal, Bruker AC 200 (200 MHz) és Bruker Avance Ultrashield 400 (400 MHz) spektrométeren történt. A fajlagos optikai forgatóképességet ([α]D20

, 20°C-on, a nátrium D vonalára, 589 nm-re

vonatkoztatva) Perkin Elmer Polarimeter 241 műszerrel határoztam meg a következő

Reakcióim kivitelezése során vékonyréteg kromatográfiát használtam a konverziók ellenőrzéséhez.

A biotranszformációk során felhasznált E. coli expressziós rendszereket Dr. Pierre E. Rouviere (E.I. Dupont Company) –től, és Prof. Margaret M. Kayser (University of New Brunswick) –től kaptam. A BVMO géneket tartalmazó plazmidokkal transzformált E. coli DH5α baktériumokat ampicillin tartalmú Luria-Bertani (LB) táptalajon növesztettem –80

°C-on tárolt glicerines kultúrákból, a reakciókhoz a táptalajról különálló baktériumtelepeket választottam ki.

A flagellin-enzim fúziós fehérjék létrehozásához a pKOT-1 plazmidot használtam, melyet a Magyar Tudományos Akadémia (MTA) Szegedi Biológiai Központ (SZBK) Enzimológiai Intézete bocsátott rendelkezésemre. Ez a plazmid pBR322 alapú, a flagellin promóterét és génjét EcoRI helyen tartalmazza. Az Acinetobacter CHMO génjét a pDR01 és a Comamonas CPMO génjét a pDR05 plazmidokból PCR-eztem (PCR: polimeráz láncreakció), amelyeket a Bécsi Műszaki Egyetemről Dr. Marko D. Mihovilovic felajánlásával használok. Plazmidok megsokszorozására minden esetben E. coli TOP10 sejteket alkalmaztam. A plazmidok tisztításához Omega E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit II-t (általában 10 ml baktériumkultúrából preparáltam plazmidot és 50 µl steril deszt. vízzel eluáltam), PCR termékek gélből izolálásához és DNS fragmentumok emésztése után Promega Wizard SV PCR-Clean-up kitet használtam. A DNS-eket a New England Biolabs Inc. restrikciós endonukleázaival emésztettem, az emésztésekhez az enzimeknek megfelelő standard protkollokat alkalmaztam, a PCR reakciókat KOD polimerázzal végeztem. A PCR-ekhez és a szekvenáltatáshoz felhasznált primereket a MTA SZBK Nukleinsav Szintézis Laboratóriumából rendeltem. A ligálásokhoz a Fermentas Rapid DNA Ligation Kit-jét használtam az ajánlott előirattal. Az emésztett plazmid defoszforilálására SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase, Promega) enzimet alkalmaztam az enzimhez tartozó leírás alapján. A DNS fragmentumok detektálására és izolálására agaróz gélelektroforézist végeztem. A DNS konstrukciók szekvenálását az MTA SZBK Szekvenáló Laborjában végezték. Az elkészült plazmidokat fehérjetermeltetés érdekében Salmonella SJW2536 flagellin-deficiens baktériumokba elektroporáltam. A baktériumok úszóképességét sötétlátóterű mikroszkóppal (Olympus BX FLA, UPlan FI 40x/0,75 objektívvel) és Malapaka és munkatársai (2007) által leírt motilitás teszttel vizsgáltam. A fehérjeminták

töményítéséhez Microcon oszlopot (30000 MWCO, Millipore, Bedford, MA, USA) használtam. A fehérjéket SDS (Sodium dodecylsulfate) gélelektroforézissel detektáltam, a fehérjekoncentrációkat Unicam Helios α fotométer segítségével határoztam meg a 280nm-en mért értékekből a fehérjék extinkciós koeffici280nm-enseit felhasználva (Ɛ₂₈₀=17880 M^-1cm^-1 a vad flagellin esetében és Ɛ280=10430 M^-1cm^-1 a D3-deléciós flagellin esetében (EXPASY)).

A vad flagellin és a D3-deléciós flagellin preparálását Vonderviszt és munkatársai (1989) alapján kiviteleztem. Cirkuláris dikroizmus (CD) mérésekhez a MTA SZBK Enzimológiai Intézetében lévő Jasco-720 spektropolarimétert használtam.

3.1.1. Cirkuláris dikroizmus

A Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia a polarizált fény és egy optikailag aktív anyag (esetemben fehérje) kölcsönhatásán alapulnak, a fehérjeoldat elforgatja a rajta keresztülbocsátott polarizált fény síkját. A CD spektroszkópiával gyorsan nyerhetünk információt a fehérjék szerkezetéről. A távoli ultraibolya tartományban (180-260nm) felvett CD spektrumból következtethetünk a másodlagos szerkezeti elemek (α-hélix, β-lemez, rendezetlen/random coil láncok) meglétére, illetve ezek arányára a fehérje térszerkezetében, míg a közeli UV tartomány (260-320 nm) az aromás oldalláncokról, azok egymáshoz viszonyított térbeli orientációjáról, vagyis a harmadlagos szerkezetről ad információt. A műszer felhasználható fehérjék különböző környezeti behatások (pl.: pH változás, hődenaturáció) során bekövetkező konformációs változások nyomon követésére is (http://esr.elte.hu/~noemi/labor/cd/cd.html). Munkám során fehérjék denaturációs hőmérsékletének meghatározására alkalmaztam. A CD mérésekből kapott görbék inflexiós pontjainak meghatározása Qtiplot program felhasználatával készült.

3.1.2. E.coli TOP10 kompetens sejt készítési eljárás

20 ml folyadék tápoldatba 50 µl előző éjjel 1 telepről felnövesztett baktériumkultúrát oltottam és felnövesztettem 37 ̊C-on, míg a 600 nm-en mért abszorbanciája elérte a 0,6-ot (kb. 3-4 óra). A sejteket 4 ̊C-on 4000 rpm-mel 10 percig centrifugáltam, innentől a baktériumcsapadékot a preparálás során jégen tartottam. Először 10 ml 0,1M MgCl2-vel óvatosan mostam a csapadékot, majd ismét kiülepítettem a sejteket, és másodszor 700 µl 0,1M CaCl2-be vettem fel. A sejtszuszpenziót 1 órán keresztül inkubáltam jégen, ezután az elkészült kompetens sejtekből 200 µl-t használtam transzformálásra. A kompetens sejtet a transzformálni kívánt plazmiddal jégen inkubáltam

1 órán át, majd 2 perc hősokk következett 42 ̊C-on. Ezt követően ismét lehűtöttem a sejteket és 800 µl folyékony LB tápoldatot adtam hozzá, amiben 37 ̊C-on 45 percig növesztettem. Ezután a transzformált sejteket kikentem a megfelelő antibiotikumot tartalmazó táptalajra.

3.1.3. Salmonella SJW2536 elektrokompetens sejt készítési eljárás

200 ml folyadék tápoldatot beoltottam 1 ml előző éjjel 1 telepről felnövesztett 20 ml-es starterkultúrából és növesztettem 37 ̊C-on, míg a 600 nm-en mért abszorbanciája elérte a 1,0-t (kb. 3 óra). Centrifugálás előtt a kultúrát 5 percig jégen inkubáltam, majd 4 on 4000 rpm-mel 10 percig fugáltam. A felülúszót leöntöttem, és a csapadékot 40 ml 4 ̊C-os steril 15%-̊C-os glicerinnel felszuszpendáltam. Ezt követően ismét centrifugáltam, és megismételtem az előző mosási lépést. A harmadik centrifugálást követően 20 ml 4 ̊C-os steril 15%-os glicerinnel mostam a csapadékot, majd ismét centrifugáltam. A csapadékot 800 µl 4 ̊C-os steril 15%-os glicerinbe vettem fel, és 40 µl-ként szétosztottam steril eppendorf csövekbe. Az így elkészített elektrokompetens sejtek -80 ̊C-on tárolhatók a felhasználásig. Az elektroporálást 3 kV-tal kiviteleztem 1-2 µl plazmid és 40 µl elektrokompetens sejt felhasználásával. Ezt követően 500 µl folyékony LB-ben növesztettem az elektroporált sejteket 37 ̊C-on 1 órán keresztül, majd kikentem a sejtszuszpenziót a megfelelő antibiotikumot tartalmazó táptalajra.