Sterilizálási eljárások

Sterilizálásnak (csíramentesítésnek) nevezzük azt az antimikrobiális eljárást, amelyek során különböző fizikai, kémiai hatásokkal, vagy ezek kombinált alkalmazásával a csíramentesítésre kerülő anyagon és anyagban elpusztítjuk, illetve irreverzibilisen inaktíváljuk a mikroorganizmusokat, valamint ezek összes nyugvó formáit.

A mikrobák a különböző fizikai behatásokra, kémiai vegyületekre igen eltérő módon reagálnak, de a kezelés hatékonysága is sok tényezőtől függ (pl. a populáció sűrűségétől, a mikrobák "kondíciójától", a hatóanyag-koncentrációtól, a környezeti feltételektől).

A sterilizálást sokféle módon lehet elvégezni. Történhet fizikai (mechanikusan, hővel, sugárzó energiával, szűréssel) és kémiai (oldat, vagy gázfázisú szerekkel) módszerekkel, de mindig a kívánalmaknak megfelelően, a sterilezendő anyagok és eszközök anyagi minőségének és a sterilizálási eljárásnak rájuk gyakorolt esetleges kedvezőtlen hatásának figyelembe vételével megválasztva azt.

Mechanikus hatások

A statikus nyomás alkalmazása elhanyagolható, mivel a mikroorganizmusok igen ellenállóak a külső nyomással szemben. A baktériumok, az élesztők és a penészek vegetatív sejtjei 300-600 MPa nyomással károsíthatók, azonban az endospórák túlélik az 1000 MPa-t meghaladó nyomást is. A gyakorlatban azonban néhányszor 100-600 MPa nyomáslökések hatására (pl. 5 percig 200 MPa, majd 5 percig 0 MPa, újból 5 percig 200 MPa, stb.) a baktériumsejtfalak felrepednek és pusztulásuk kimutatható.

Különböző sejtek feltárásánál, vagy baktérium kivonatok készítésénél alkalmazzák a fagyasztást és az olvasztást egymás után többször váltakozva (a képződő jégkristályok okozzák a sejtek károsodását), illetve az ultrahanggal való kezelést, vagy jelentős nyíróerőket keltve (eldörzsölés, üveggyöngyökkel történő rázatás, stb.) roncsolják a sejteket. Azonban ezek a módszerek nehézségük miatt inkább csak speciális célokra használhatók, illetve nem minden esetben érhető el teljes csíramentesség.

Sterilizálás hővel Sterilizálás száraz hővel

A száraz hő hatása alapvetően a sejtek víztartalmának eltávolításán és ezt követő oxidációján alapszik.

Nyílt lánggal történő sterilizálás olyan esetekben alkalmazható, ha a csírátlanítandó tárgy a lánggal közvetlenül érintkezve nem károsodik. Különböző laboratóriumi eszközök (szike, kés, oltótű, oltókacs) nyílt lángon izzítva gyorsan és biztosan sterilezhetők.

A száraz hővel történő sterilezést hőlégsterilizátorokban végezzük. Ezek termosztátos rendszerű, meghatározott hőmérsékletre beállítható elektromos szekrények (legtöbbször légkeveréssel ellátva). Száraz hővel csak hőálló fém-, üveg-, porceláneszközöket, glicerint, vazelint, olajokat, zsírokat és hőstabil porokat sterilezhetünk, amelyek pl. ilyen cirkulációs típusú rendszerben az endospórás baktériumok biztos elpusztításához szükséges hőmérsékleteket elbírják: 160 °C-on 45 perc; 180 °C-on 25 perc; 200 °C-on 10 perc.

Sterilezés nedves hővel

A víz hővezetése sokszorosa a levegőének, így nedves meleg víz vagy vízgőz jelenlétében alkalmazott hőhatás lényegesen gyorsabban és hatásosabban sterilizál, mint a száraz hő.

A nedves hő alkalmazásának legegyszerűbb és legrégebbi módja a kifőzés. A forrásban lévő víz hőfoka normál légköri nyomás mellett a 100°C-ot nem haladja meg, ezért a különösen ellenálló endospórás baktériumok a 10-15 perces kezelésnél nem pusztulnak el, így sterilizáló hatás a kifőzés során nem várható.

A pasztőrözés részleges csírátlanítás nedves meleggel. A tejet sok mikrobától mentesíthetjük egy alkalommal végrehajtott, 30 perces 65°C-os vagy 5 perces 85°C-os melegítéssel, de a kezelést nem csak egyes endospórás baktériumok, hanem hőre kevésbé érzékeny szervezetek, mint pl. a saválló sejtfalasMycobacteriumspp. sejtjei is túlélhetik. Azonban ultrapasztőrözés esetén a tej, illetve tejszín 135-150 °C-on 2 mp-es hőtartással való kezelése során a termék gyakorlatilag csirátlanná válik.

A tindállozás (frakcionált csíramentesítés, John Tyndall [1820-1893] angol fizikusról elnevezett eljárás) során a sterilizálásra szánt táptalajt, vagy oldatot, naponta egy alkalommal, négy napon át 60°C feletti hőmérsékletre melegítik, majd a következő kezelésig termosztátban inkubálják. Az egyes melegítések alkalmával a vegetatív alakok elpusztulnak, feltehetőleg az utolsó melegítés már az utolsónak kicsirázott endospórákat pusztítja el.

Hőérzékeny tápközeg komponensek esetén (pl. zselatin) alkalmazhatjuk.

Sterilizálásra a leghatásosabb módszer a túlnyomáson, telitett vízgőz jelenlétében alkalmazott nedves hő. Ez a hétköznapjainkban is széles körben elterjedt, amikor is az otthoni kuktákban, nyomás alatt, gőzben főzzük az ételeinket. Ilyen kuktáknak foghatók fel a laboratóriumi autoklávok, melyek lényegében hermetikusan záró, nagy belső nyomást kiálló nagyméretű tartályok. A sterilizálandó tárgyakat behelyezve abban gőzt fejlesztenek. Az autokláv zárt terében a nyomás növelésével párhuzamosan emelkedik a hőmérséklet, így pl. az 1 atm túlnyomás elérésekor a telített gőz hőfoka eléri a 121°C-ot. Ezt a hőmérsékletet a legtöbb mikroba nem képes elviselni 10 percen túl (kivétel pl. prionok, hipertermofil baktériumok). Biztonsági okokból a sterilezési idő ennél hosszabb:

30, illetve 20 perc.

Sterilizálás sugárzással

Csírátlanításra elterjedten használt energiafajták a különböző sugárzások (pl. UV-, röntgen-, radioaktív-sugárzás) is, amelyeknek előnyük, hogy hőérzékeny anyagok esetében is alkalmazhatók. A hőhatáson alapuló mikrohullám sugárzásnak is van antimikrobiális hatása, de a kezelendő tárgy anyaga meghatározza a sejtpusztító hatást (pl. a hőhatás egyeletlenül éri a különböző méretű anyagokat).

Az UV-sugárzás teljes spektruma (4-400 nm) károsíthatja a sejteket, de csupán szűk része felelős az ún. germicid hatásért. 265 nm környékén igen erőteljes „csíraölő” hatás érhető el, mert ennél a hullámhossznál van a DNS abszorpciós maximuma. A sejtpusztulás legfőbb oka a nukleinsavakban pirimidin dimerek képződése. A nukleinsavakat ért károsodásokat a baktériumok különböző hibajavító mechanizmusokkal képesek kijavítani, azonban a károsodások bizonyos szintje felett az enzimrendszerek kapacitása már nem elégséges és így a mutációk felhalmozódása a sejt pusztulását okozza. A germicid lámpák használata ózonképződéssel is jár (másodlagos germicid hatás). Ebben az esetben a germicid sugárzás (főként a 185 nm-en is sugározó lámpa) ionizálja az oxigént

és ózon (O₃) keletkezik, ami rendkívül erős oxidálószerként, fertőtlenítőszerként ismert. Mint instabil molekula oxigénmolekulára (O₂) és egyatomos, rendkívül reagens, úgynevezett naszcensz (atomi állapotú) oxigénre ('O') bomlik. Utóbbi oxidálható anyagokkal pl. mikroorganizmusokkal érintkezve, azok pusztulását okozza. Az UV (germicid)-lámpákat elterjedten alkalmazzák kórházakban, laboratóriumokban a légtér és felületek csíramentesítésére.

Alkalmazhatóságának határt szab, hogy hatékonysága a fényforrástól távolodva négyzetes arányban csökken, áthatolóképessége kicsi, és hatékonyságát a felületeken található szennyeződések a sugárelnyelés révén jelentősen csökkentik.

A nagy energiájú ionizáló sugárzások közül ipari méretekben a jó áthatolóképességű, rendszerint⁶⁰Co-izotópból származó gamma-sugárzást használják egyszer használatos injekciós tűk, fecskendők, kötszerek, gyógyszerek és egyes élelmiszerek (pl. fűszerek) sterilezésére. A gamma-sugárzás előnye, hogy a csomagoláson is áthatol, hátránya, hogy alkalmazására különleges felszerelést igényel, mert mint minden radioaktív sugárzás permanens, és minden irányba szóródik.

Sterilizálás szűréssel

A mechanikus úton történő csíramentesítés legáltalánosabban alkalmazott módszere a szűrés, amikor is a sterilizálandó folyadékot, vagy gázt olyan pórusméretű, illetve adszorpciós felületű szűrőfelületeken préseljük át, amely a mikroorganizmusokat visszatartja és a szűrlet sterillé válik. Ez a módszer hatását tekintve nem felel meg teljesen a sterilizálás alapelveinek, mert a mikroorganizmusok a szűrés során nem pusztulnak el. A szűrök pórusainak átmérőjét úgy kell megválasztani, hogy azon a baktériumok és más sejtes elemek, illetve vírusok ne juthassanak át.

A mikroorganizmusok szűrésére korábban Seitz-féle azbeszt-, vagy különböző zsugorított üvegszűrőket alkalmaztak.

A modern membránszűrők általában cellulóz-észter (pl. cellulóz-acetát), poliészter, teflon típusú anyagokból készülnek, működésük részben a mikrobák adszorpcióján, részben mechanikus szitahatáson alapul. A tisztán szitahatáson alapuló szűrők előnyösek, mivel azok nem változtatják meg a szűrendő oldat összetételét. A baktériumok eltávolítására a 0,22 μm átmérőjű membránszűrők a legalkalmasabbak, ám ezek a vírusokat áteresztik, utóbbiak kiszűrésére még finomabb pórusméretű (0,02-0,05 μm) szűrőket alkalmaznak.

A membránszűrők biológiailag semlegesek, nem akadályozzák a szűrőn fennmaradt mikroorganizmusok élettevékenységét, nem gátolják az enzimműködésüket, az anyagok jól diffundálnak a membránon keresztül, így különféle táptalajokra helyezve a baktériumok könnyen tenyészthetők rajtuk (4.8/1. kép). Ezen kívül festhetők, fénymikroszkóp alatt megvizsgálhatók.

4.8/1. kép. Membránszűrőre koncentrált vízmintából kifejlődő színes kolóniák szilárd táptalaj felszínén (Fotó: Máthé István)

Sterilizálás kémiai módszerekkel

A kémiai anyagok széles köre alkalmas a mikrobák gátlására (lásd fertőtlenítőszerek rész). Az anyagok egy része csupán szaporodásában gátolja a baktériumokat (bakteriosztatikus hatás), más része viszont elöli (baktericid hatás).

Az, hogy egy anyag sztatikus vagy cid hatású, az anyagi minőségen kívül függ a koncentrációtól és a behatási időtől is. A kémiai sterilezésre csak cid hatású anyagok alkalmasak. Ezekkel szembeni követelmény, hogy hatásuk széles spektrumú legyen (pl. fungicid gombaölő, virucid vírusölő, sporocid spóraölő), ne legyenek toxikusak magasabb rendű szervezetre, ne lépjenek káros reakcióba a kezelendő anyaggal, ne legyenek bomlékonyak, viszont elvárjuk, hogy környezetkímélők, könnyen kezelhetők és gazdaságosak legyenek.

A kémiai sterilezésre használt anyagok lehetnek folyékony, vagy gáz halmazállapotúak. A folyékony szereket főként felületek sterilezésére használják. A gáz halmazállapotú vegyületek jelentőségét az ún. gázzal sterilizáló berendezések adják. Sokféle antimikrobiális hatású gázt ismerünk, de a legelterjedtebbek az etilén-oxiddal, a béta-propiolaktonnal, illetve formaldehid gőzökkel működő berendezések. Ezek a vegyszerek alkiláló hatásuk révén a mikrobiális fehérjéket, mind pedig a nukleinsavakat károsítva a mikrobák pusztulását okozzák. A sterilizálandó anyagokat nem károsítják, ezért különösen a papír, gyógyászati textíliák és a hőre lágyuló műanyagok sterilezésében van nagy jelentőségük. A gázokkal és gőzökkel sterilezett anyagok és eszközök nem használhatók fel azonnal, hanem meghatározott ideig szellőztetni kell őket, hogy toxikus hatásuk megszűnjön. A nagytisztaságú mikrobiológiai szekrények (lamináris boxok) "záró sterilizálását" is formaldehid gőzzel végzik. A "gázsterilizátorok" alkalmazása nagy körültekintést igényel, mert az alkilező hatású vegyületeknek erőteljes rákkeltő hatásuk van (az etilén-oxidos berendezéseket ez miatt már betiltották).