A glikolízishez kapcsolódó fermentációk

Az Embden-Meyerhof-Parnas-úthoz kapcsolódó erjesztési folyamatokban a szénhidrátok oxidációja a glikolízis reakciósorán át a piroszőlősavig halad, miközben szubsztrátszintű foszforilációval két molekula ATP keletkezik és két molekula NAD⁺redukálódik. A piruvátból kiinduló fermentációs lépés, vagy lépések során aztán a redukált NAD⁺oxidálódik, miközben elektron donorként szolgál a különböző fermentációs termékek képzéséhez.

Homofermentatív etilalkoholos erjedés

Az etilalkoholos erjedésnél, a glükózból a glikolízis útján piroszőlősav, majd ebből etanol és szén-dioxid keletkezik.

A piruvát dekarboxiláz hatására a piroszőlősavról egy CO₂lehasad és így acetaldehiddé alakul. Ez aztán - az alkohol-dehidrogenáz katalizálta folyamatban - alkohollá redukálódik, miközben egy NADH +H⁺oxidálódik.

Ez az etanolos erjesztés főként a gombákra, és közülük is az élesztőgombákra, aSaccharomycesfajokra jellemző.

A baktériumok közül a Sarcina ventriculi fermentál ezen az úton. A többi procariótánál az etilalkohol nem önmagában, hanem mindig valamilyen más erjesztési végtermékek társaságában jelenik meg.

Az élesztőgombák eukarióta szervezetek, melyek aerob környezeti feltételek mellett a glükózból képződött piroszőlősavból, a citromsav-cikluson és a terminális oxidáción át nagy mennyiségű energiát (38 ATP/1molekula glükóz)) nyernek és gyorsan szaporodnak. Anaerob feltételek között pedig a fermentálnak, a piroszőlősavból etilalkoholt képeznek, miközben energiát csak szubsztrátszintű foszforilációval nyernek (2 ATP/1 molekula glükóz).

Ilyen szervezeteket találunk például aPichia,Hanseniaspora,Brettanomycesés aSaccharomycesnemzetségbe tarozó fajok között.

Ezt a tulajdonságukat tapasztalati alapon évezredek óta hasznosítják. Napjainkra pedig már tudományos eredmények is megalapozzák széleskörű ipari és mezőgazdasági alkalmazásukat.

Így például a sörgyártásban, amihez malátát, vizet, komlót és élesztőt használnak. A sör erjedésénél szubsztrátként szolgáló cukrok, az árpa keményítőtartalmának enzimatikus (α-, β-amiláz, glulozidáz) bontása során képződnek.

Ezeket aztán aSaccharomyces cerevisiaeés aS. carlsbergensistörzsekkel erjesztik, aminek során alkohol és szén-dioxid keletkezik. A szénszén-dioxid a sörgyártás mellékterméke, amit sok helyen hasznosítanak. A komló pedig az ízanyagokon túlmenően, antibakteriális tulajdonságai révén, a nem kívánatos mikrobák szaporodását is visszaszorítja.

A borászat is ezen az erjedésen alapul. A szőlő nagy mennyiségű szénhidrátot, főként répacukrot tartalmaz, ami részben az érés, részben a feldolgozás során glükózzá és fruktózzá bomlik. Az élesztők azután e két vegyületből alkoholos fermentációval etilalkohot és szén-dioxidot képeznek. Az erjesztést a szőlőn, illetve a mustban jelen lévőKloeckeraésHanseniasporafajok indítják, de kis toleranciájuk miatt 3 - 5 tf% alkoholtartalomnál ezek már elpusztulnak. A fermentációt ettől kezdveSaccharomycestörzsek viszik tovább. ASaccharomyces vinilegjobb törzseivel erjesztett mustból kitűnő minőségű, még 16 tf% -osnál nagyobb alkoholtartalmú borokat is nyernek.

Pálinkakészítéskor pedig a kierjedt gyümölcscefre desztillálását, lepárlását követően, 40-60% alkoholtartalmú italt kapunk. A gyümölcscefréket ebben az esetben a saját törzseik erjesztik, vagy ipari méretekben borélesztőkkel oltják őket.

De a kelesztett kenyérről se feledkezzünk meg, mivel annak lágy, lyukacsos szerkezetét is az alkoholos erjesztés során képződött CO₂-nak köszönhetjük.

A nagy keményítő tartalmú kukorica és burgonya felhasználása mellett/helyett, az emberi élelmezésre nem hasznosítható nyersanyagokból (mint pl. kukoricaszár és rost, kenderpozdorja, hulladékpapír, kommunális hulladék) ipari méretekben előállított etanol pedig jó alternatíva a fosszilis üzemanyagok és a kőolaj alapú termékek kiváltására.

Glicerines erjedés

1. Ha a glikolízis során keletkezett NADH + H⁺-t az alkohol-dehidrogenáz helyett a glicerinfoszfát-dehidrogenáz regenerálja, glicerin képződik. Ennek megfelelően, az etanolos erjedés során az etilalkohol prekurzorát, az acetaldehidet elvonva, a NADH + H⁺a dihidroxiaceton-foszfátra kerül, és az etanol helyett glicerin keletkezik.

(8.1/2. ábra)

A glicerines erjedés és a nagy (7-24 g/l) glicerintartalom például az aszú borokra jellemző, növeli az édes érzetet és a bor testességét.

8.1/2. ábra. A glicerines erjesztés folyamata

2. Más baktériumok, (így pl. egyes Bacillus fajok), heterofermentatív glicerines erjesztést valósítanak meg.

Végtermékeik szerint ennek több típusa ismert.

A glicerin-butándiolos fermentáció során a piroszőlősavból, pontosabban az ebből keletkező acetaldehidből acetoin, ill. butándiol képződik.

A glicerin-ecetsavas-alkoholos fermentáció eredményeként a glicerin mellett etanol és ecetsav jelenik meg, míg a glicerin-acetonos és glicerin-izopropanolos erjesztés végtermékei között aceton, illetve izopropanol szerepel.

2 glükóz → 2 glicerin + 2 acetát + etanol + 2 CO₂ 2 glükóz → 2 glicerin + 2 aceton (vagy izopropanol) + 3 CO₂

A glicerint főként a kozmetikai ipar, a glicerin-karbonátot pedig, amit oldószerként is alkalmaznak, a kozmetikai mellett a polimeripar is széles körben hasznosítja.

Butilalkoholos-vajsavas fermentáció

Butilalkoholos-vajsavas erjesztéssel a piroszőlősavból végtermékként ecetsav, vajsav, butilalkohol, aceton, izopropil-alkohol, etanol, CO₂és H₂képződhet. (8.1/3. ábra)

8.1/3. ábra. A butilalkoholos-vajsavas fermentáció folyamata

A fermentáció során a piroszőlősav először dekarboxileződik, és egy koenzimA-hoz kapcsolódik. Kis redoxpotenciál érték mellett a folyamatban résztvevő NADH + H⁺regenerálásában a ferredoxin H2-képzéssel vesz részt.

Az igy képződőtt acetil-koenzimA-ból, illetve a koenzimA felszabadulása mellett, annak acetil-csoportjából pedig több irányban futhatnak tovább a fermentációs folyamatok.

Az elsőben a NADH + H⁺-dehidrogenáz hatására az acetil-csoport előbb acetaldehiddé, majd etilalkohollá redukálódik.

A másodikban egy foszforsav belépésével acetil-foszfát, majd ecetsav jön létre, miközben egy ATP szintetizálódik.

Ez az ecetsav aztán az acetil-koenzimA-val reagálva aceto-acetil-koenzimA-t hoz létre, ami újabb két irányt szab a folyamatnak. Egyrészt egy hidrolizist és dekarboxilezést követően – a koenzimA felszabadul - és aceton, illetve ebből egy hidrogénfelvétellel izopropilalkoholt lesz.

Másrészt az aceto-acetil-koenzimA NADH + H⁺függő redukciójával, 3-hidroxi-butiril-koenzimA-n és krotonil-koenzimA-n át egy újabb redukciós lépést követően butiril-koenzimA képződik. Ebből aztán egy anorganikus foszfát belépésével butiril-foszfát, majd vajsav jön létre, miközben ATP szintetizálódik. És ez a fermentációs folyamatok fő iránya, míg a másik alternatív úton a butiril-koenzimA butilalkohollá redukálódhat. (8.1/3. ábra) Az erjesztési folyamatok során az egyes termékek egymáshoz viszonyított aránya változik. Az első szakaszban – a sejtek exponenciális szaporodásának idején - a pH csökken, (kb. pH=5,2-re), amit a szerves savak, az ecetsav és főként a vajsav képződése okoz. Ennek hatására a sejtek gyors szaporodása és a savképzés csökken. A stacioner növekedési fázisba kerülő sejtek ekkor már egyre inkább acetont és butanolt állítanak elő. A folyamat előrehaladtával a pH is emelkedik. Elegendő NADH + H⁺jelenlétében a sejtek újra felveszik a megtermelt butirátot és butanollá redukálják. A butanol termelés kb.1,3%-os koncentráció felett áll le. Az acetont csak kevés mikróba (pl.Clostridium aurantibutyricum, Clostridium butyricum, C. beijerinckiitörzsei) redukálja izopropanollá.

A fermentációs termékek minőségi megoszlását a faji, ill. törzsi identitás mellett a tenyész- illetve a fermentációs körülmények, mint például a hőmérséklet, pH, stb. is befolyásolják.

Butilalkoholos-vajsavas fermentációra számos mikroorganizmus képes:Butyribacterium, Zymosarcina, Neisseria, Clostridium(C. acetobutylicum, C. butyricum, C. pasteurianum).

Ipari fermentációkhoz a Gram pozitív, endospóra képző Clostridium, és ezen belül is főként a Clostridium acetobutylicumés aClostridium butylicumtörzseket használják.

A baktériumok butanol termelését Pasteur már 1861-ben leírta, Chaim Weizmann pedig 1912-ben kitenyésztette a fermentációja során acetont, etanolt és butanolt képzőClostridium acetobutylicumt. És ettől kezdve a fermentáció szinte minden termékét hasznosították. Az első világháború előtti időkben a szintetikus gumi gyártásához használt butadién, a háború alatt a TNT (trinitrotoluol) robbanóanyaghoz szükséges aceton, míg 1918 után a cellulóz-nitrát előállításához felhasznált butanol volt a főtermék. Ma már a petróleum alapú termékek nagyrészt helyettesítik, de mégsem szorították ki teljesen a fermentációs termékeket. A Clostridium acetobutylicum törzsekkel pl.

kukoricakeményítőből, melaszból és szacharózból állítanak elő butanolt, acetont, izopropanolt és etanolt.

A tejiparban azonban a nemkívánatos erjedési formák, és így aClostidium butyricumis a nemkívánatos baktériumok közé tartozik, mivel a sajtok másodlagos vajsavas erjedését és puffadását okozza.

Butilén-glikolos fermentáció

Butilén-glikolos fermentációra számos mikroorganizmus képes. Így például azEnterobacter,Klebsiella (Klebsiella pneumoniae), Serratia, Pseudomonas, Aeromonas és Bacillus (Bacillus polymyxa) genusz tagjai, a melyek piroszőlősavból 2,3-butilén-glikolt, etanolt, tejsavat, hangyasavat, szén-dioxidot és hidrogént állítanak elő.

A folyamat során az α-acetolaktát-szintáz hatására két piroszőlősav kondenzációja, és dekarboxileződése révén előbb α-acetolaktát, majd acetoin keletkezik, aminek a 2,3-butándiol-dehidrogenáz katalizálta redukciója hozza létre a 2,3-butándiolt.

A piroszőlősavból még tejsav, a piruvát-formiát-liáz hatására hangyasav, illetve ebből szén-dioxid és hidrogén keletkezik. Egy további alternatív úton pedig két dehidrogenáz katalizálta redukciós lépéssel acetil-koenzimA-n és acetaldehiden át etanol a végtermék. (8.1/4. ábra)

8.1/4. ábra. A butilén-glikolos erjesztés folyamata Vegyes savas fermentáció

AzEscherichia,Salmonella,Shigella, ésProteusgenuszok tagjait az un. vegyes savas erjesztés jellemzi, aminek során tejsav, etanol, ecetsav, hangyasav, borostyánkősav, szén-dioxid és hidrogén termelődik. (8.1/5. ábra) Az erjesztés során a piroszőlősavból egyrészt a laktát-dehidrogenáz hatására tejsav képződik, másrészt a piruvát-formiát-liázzal acetil-koenzimA-ra és hangyasavra bomlik. Az utóbbi esetleges bomlása CO₂ és H₂ gázokat eredményez.

Az acetil-koenzimA acetilcsoportjából pedig a dehidrogenázok hatására acetaldehiden át etilalkohol képződik, a foszfotranszacetiláz és egy kináz katalízisével meg acetil-koenzimA-n keresztül ecetsav keletkezik.

Egy másik úton, a foszfo-enol-piruvátból egy szén-dioxid felvételével oxálecetsav, majd ennek redukálásával almasavon és fumársavon keresztül borostyánkősav képződik.

8.1/5. ábra. A vegyes savas erjesztés folyamata

A butilén-glikolos és vegyes savas fermentáció egyaránt a jellemző az enterobaktériumokra. Diagnosztikájukban ezek megléte vagy hiánya, fontos határozó bélyeg.

Propionsavas erjedés

Fermentációja során számos mikroorganizmus, így pl. a Bacteriodes, Clostridium, Corynebacterium, Micromonospora,Neisseria,PelobacterésPropionibacterium, Veillonella,nemzetségek tagjai képesek propionsavat előállítani. A propionsavas fermentáció két fő típusát különböztethetjük meg.

1.AClostridium propionicumaz alanin erjesztése során nyert piroszőlősavból, illetve az ebből képződött tejsavból képez propionsavat. De ezt az utat a speciális fermentációs utaknál tárgyaljuk, mivel nem az Embden-Meyerhof-Parnas útra épül.

2.APropionibacteriumok más úton, a Wood-Werkman-ciklus során állítanak elő piroszőlősavból propionsavat, szén-dioxidot és ecetsavat (2:1:1 arányban).

A fermentáció során a piroszőlősav egy részéből szén-dioxid és ecetsav keletkezik. Más piroszőlősav molekulák egy szén-dioxid felvételével oxálecetsavvá, a malát-dehidrogenáz hatására almasavvá, majd fumársavon át borostyánkősavvá alakulnak. Az ebből létrejövő szukcinil-KoA-ból a metil-malonil-koenzimA-mutáz és epimeráz hatására metil-malonil-koenzimA képződik, ami aztán dekarboxilálódik. Az így kapott propionil-koenzimA-ról pedig propionsav szabadul fel.(8.1/6. ábra)

8.1/6. ábra. A propionsavas erjedés reakcióútja

APropionobacteriumok Gram pozitív, nagy GC tartalmú, aerotoleráns szervezetek. Porfirineket (pl.citokrómot) tartalmaznak.

Az anaerob és microaerofil környezetben egyaránt aktívPropionibacterium freudenreichiiígy az anaerob fermentáció és a respiráció valamennyi enzimének szintéziséhez szükséges gént hordozza. (8.1/7. ábra)

8.1/7. ábra. A piroszőlősav Wood-Werkman úton történő (piros vonallal jelölt) anaerob fermentatív, valamint a Szent-Györgyi-Krebs cikluson át futó (szürke színnel jelölt) oxidatív bontása – a Propionibacterium

freudenreichii esetén

A Propionobacteriumok az emberi bőr normál biotájának tagjai, bár a Propionibacterium acne gyulladásos folyamatokat is okozhat. Legnagyobb számban a kérődzők gyomrában, béltraktusában találhatók, ahol a Propionibacteriumok és aVeilonellafajok részben a növényi szénhidrátok bontásából nyert piruvát, részben a citrátkör intermedierjeinek, valamint a glicerin átalakításával képeznek propionsavat.

Bár a tejben nem találhatók, fontos szerepük van a sajtkészítésben.Propionibakterium(pl.Propionibacterium freudenreichii) kultúrákat használnak a sajtok (pl. Greuyer, Emmentál, Pannónia) érleléséhez. Ez adja a svájci sajtok jellegzetes aromáját, csípős ízét.

Homofermentatív tejsavas erjedés

A homofermentatív tejsavas erjesztők a laktát-dehidrogenáz katalízise mellett, piroszőlősavból tejsavat képeznek, miközben egy molekula HADH⁺+ H⁺oxidálódik.

Ily módon például aLactobacillus helveticusvagy a Lactobacillus delbruckiisubsp.bulgaricusegy molekula glükózból, a glikolízis útján két piroszőlősavat képez, ami azután két molekula tejsavvá redukálódik. A redukció 2 ATP képzését és a NAD⁺regenerálódását eredményezi.

A tejsavbaktériumok (Lactobacillaceae) aFirmicutesosztályba tartozó Gram-pozitív, pálca alakú, obligát fermentáló szervezetek. Energiát kizárólag tejsavas erjedéssel nyernek. Porfirineket (citokróm, kataláz) és ezzel együtt légzési láncot sem tartalmaznak. Oxigén jelenlétében is fermentálnak, és ilyenkor flavoprotein-oxidáz, illetve nikotinamid-dinukleotid peroxidáz aktivitásuk révén hidrogén-peroxidot képeznek. Még pH 4,4-es értéknél is növekednek. A fermentációs folyamatot általában a tejsav 2%-os koncentrációja állítja le.

A táptalajok összetételével szemben igényesek, növekedésükhöz fehérjéket és vitaminokat is igényelnek. Bár számukra is a glükóz a legkönnyebben asszimilálható szénforrás, többségük a laktózt is bontja. A laktóz

membrántranszportja a Lactobacillus deldrueckiisubsp. bulgaricusés Lactobacillus helvetius esetén a laktóz-permeáz-β-galaktozidáz úton, míg a Lactobacillus lactisés Lactobacillus casei fajoknál a foszfo-enolpiruvát-foszfotranszferáz és foszfo- β-galaktozidáz rendszeren át történik.

ALactobacillus amylophilusés Lactobacillus amylovoruspedig a keményítő hidrolízisére és homofermentatív tejsavas erjesztésére is képes.

ALactobacillus-ok a hüvely és a bélcsatorna normál biotájának tagjai, és ez utóbbi első kolonizálói közé tartoznak.

Megtalálhatók tejben és tejtermékekben, ahol főként aLactobacillus acidophilus,Lactobacillus lactissubsp.lactis éssubsp.cremoris, valamint aLactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricustölt be fontos szerepet az aludttej és túró keletkezésénél. A fermentált húskészítményekben (mint pl. a kolbász, szalámi) a Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus stb. tejsavas fermentációja biztosítja a húsfélék eltarthatóságát. Az autolizáló növényi szövetekben pedig főként aLactobacillus plantarumnak van meghatározó szerepe: a káposzta savanyításánál, a siló stb. előállításánál.

Az élelmiszeripar az évezredes tapasztalatokat a legújabb kutatási eredményekkel ötvözve hasznosítja a tejsavbaktériumokat. A tejsavas erjesztés gyakorlati alapjait a tejtartósítás és sajtkészítés során rakták le, amit aztán a zöldségek, és a húsok tartósítása követett. A XIX. századtól pedig már elérkezett az ipari méretű fermentációs módszerek kidolgozásának ideje.

De a fermentációs alapú tejsavat az ipar más területein, mint például a műanyagiparban is hasznosítják: dehidratált formája az akrilsav polimer alapanyaga. A politejsav - a tejsav lineáris poliésztere, (nem meghatározott lánchosszal) – pedig a biodegradálható műanyagok gyártásának prekurzora. (Mai tudásunk szerint a legtöbb politejsav bontó mikroorganizmus aPseudonocardiaceaecsaládba tartozik.)

A homofermentatív módon erjesztők magas tejsavhozama - ami 2-4 nap alatt a rendelkezésükre álló szénforrás akár több mint 90%-nak tejsavvá alakítását jelenti - az alapja a hatékony és iparilag versenyképes bakteriális tejsavtermelésnek.

Tejsavképzésük alapján obligát homofermentatív, valamint fakultatív és obligát heterofermentatív fajokat különböztethetünk meg.

Az obligát homofermentatívak a cukrokat a glikolízis útján bontják, és fő végtermékük a tejsav. A heterofermentatív tejsavas erjedést végzők (pl.Lactobacillus reuteri), a tejsavon kívül ecetsavat vagy etanolt és szén-dioxidot is termelnek - de ez már a penzóz-monofoszfát-söntre alapuló fermentáció. A fakultatív törzsek pedig a környezet változása (pl. a szénhidrát típusa és koncentrációja) szerint módosítják anyagcsere útjukat és válthatnak homofermentatívról heterofermentatív bontásra: így a hexózokat a glikolízisen keresztül, míg a pentózokat a pentóz-monofoszfát úton hasznosíthatják (8.1/8. ábra). Ilyen pl. aLactobacillus caseisubsp.casei,Lactobacillus sakei, Lactobacillus plantarum,Lactobacillus rhamnosus,Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei.

8.1/8. ábra. Az Embden-Meyerhof-Parnas úthoz kapcsolódó homofermentatív és a pentóz-foszfát úthoz kapcsolódó heterofermentatív tejsavas erjedés összehasonlítása

In document Bevezetés a prokarióták világába (Pldal 178-188)