Poliszacharidok bontása

Keményítő bontás

A keményítő D-glükóz egységekből felépülő poliszacharid, ami számos szervezetben tartalék tápanyagként szolgál, és a baktériumok számára kiváló energiaforrás.

A keményítőt két komponens, az amilóz és az amilopektin építi fel (7.2/5. ábra). Az amilóz líneáris szerkezetű, és benne a glükóz molekulák mindvégig α (1,4) glikozidos kötéssel kapcsolódnak, míg az amilopektint elágazó szerkezet jellemzi, ahol az alapláncban α (1,4) glikozidos kötéssel, míg az elágazásoknál α (1,6) glikozidos kötésekkel kapcsolódnak a glükóz molekulák.

7.2/5. ábra. A keményítőt felépítő amilóz és amilopektin szerkezete, valamint az ezeket bontó enzime

A mikrobák által termelt enzimek az amilózt és az amilopektint egyaránt jól és gyorsan hidrolizálják. A bontásért valójában több enzim, egy enzimkomplex felelős. Aminosav-szekvenciájuk alapján azonban ezeknek a keményítőbontó enzimeknek a legtöbbje homológ sort alkot és egy családba, az α-amilázok vagy glikozilhidrolázok családjába tartozik.

Az α-amiláz főként az α (1→4)- és némely esetben az α (1→6) glikozidos kötéseket is bontja. Bontása a molekulalánc belsejében véletlenszerűen történik, és mintegy feltördeli, felaprózza a poliszacharidot. Ennek eredményeként oligoszacharidok, maltóz (diszacharid) és némi glükóz képződik.

A β-amiláz is bontja a keményítő mindkét alkotórészét. De az előzővel ellentétben ez az emzim kizárólag az α (1→4) glikozidos kötéseknél támad, és mindig a láncvégekről hasít le maltóz egységeket. A maltózt aztán az α-glükozidáz bontja tovább glükóz molekulákká.

Az α-glükozidáz az α-térállású glikozidos hidroxilt tartalmazó glükóz glikozidjait hidrolizálja, legyen az akár α (1→4) vagy α (1→6) glikozidos kötés.

Az amilopektin elágazások α (1→6) glikozidos kötéseit a pullanáz és izoamiláz enzimek bontják. (7.2/5. ábra) Az így nyert glükózt - aztán a membrán transzport során - egy karrier protein ATP vagy foszfoenolpiruvát terhére foszforilálja, és a citoplazmában már mint foszforilált cukormolekula a glikolízis, a pentóz-foszfát- vagy az Entner-Doudoroff-úton át beléphet a sejt katabolikus folyamataiba. Oxidatív körülmények között pedig ezeket követően a Szent-Györgyi-Krebs-ciklusba. A terminális oxidációt is figyelembe véve ez esetben egyetlen glükóz molekulából 32-33 ATP keletkezhet. Ha pedig tekintetbe vesszük, hogy egy keményítő molekula amilóz alapláncát ezer, a hozzá kapcsolódó amilopektint pedig akár több tízezer glükóz molekula alkothatja, jól látható, hogy energetikailag mennyire gazdaságos ennek a poliszacharidnak a bontása.

A sejtben tartalék tápanyagként raktározott keményítőt az intracelluláris, a környezetéből tápanyagként hasznosított keményítőt pedig a baktérium extracelluláris enzimei hidrolizálják.

A keményítő bontó enzimek széles körben megtalálhatók a prokariotákban, tartozzanak ezek akár aBacteria(pl.

Bacillusspp.) akár azArchaeadoménba.

Az α-amilázt az élelmiszeripar is nagymértékben hasznosítja. A sütőiparban a keményítő hidrolízisére először a Bacillus amiloliquefaciens,majd aGeobacillus stearothermophilusvagyBacillus licheniformisbaktériumtörzsekből izolált α-amilázt alkalmazták. De használnak még α-amilázt sörök és gyümölcslevek derítésénél, valamint a mosó-és mosogatószerek adalékanyagaként is.

Cellulóz bontás

A keményítőhöz hasonlóan a cellulózt is glükóz egységek építik fel. De míg a keményítő α-glükóz egységekből áll, a cellulózt β-glükóz monomerek alkotják. További különbség, hogy a vízben oldódó, spirális térszerkezetű keményítővel ellentétben, a cellulóz molekula lánc alakú és vízben gyakorlatilag oldhatatlan.

A cellulóznak, - a bioszféra legnagyobb mennyiségben képződő poliszacharidjának - a bontása tehát jelentős kihívás a baktériumok számára.

A cellulóz glükóz molekulákból felépülő lineáris poliszacharid, aminek a láncában β-1,4-glükozidos kötéssel kapcsolódnak az anhidro-glükóz monomerek. Az elágazás nélküli lánc β–glükóz egységei változó térállásban (alsó és felső), egymáshoz képest 180°-ban elfordulva kapcsolódnak össze. Bár monomereit tekintve a cellulózt glükóz molekulák építik fel, a lánc szerkezetének ismétlődő egysége a két glükóz maradékból álló cellobióz (7.2/6. ábra).

7.2/6. ábra. A cellobióz egység szerkezeti képlete

7.2/7. ábra. A cellulóz inter- és intramolekuláris kötései

A párhuzamosan futó láncokat hidrogén- és van der Waals-kötések kötik össze. A poliszacharid szupramolekuláris szerkezetét a láncon belül és a láncok között lévő hidrogén-kötések biztosítják. (7.2/7. ábra)

A cellulóz szerkezeti komplexitása és heterogenitása nagymértékben nehezíti a lebontási folyamatokat. A mikrofibrillák nagyszámú intermolekuláris hidrogén-kötéssel bíró kristályos és kevéssé rendezett amorf régióit ugyanis eltérő fizikai és térbeli elrendeződés jellemzi. Ez pedig a degradáló enzimek kötődését nehezíti, és azok sokféleségét vonja maga után.

Mind a bakteriális, mind a gomba eredetű cellulázokat bifunkciós domén-szerkezet jellemzi. A cellulózkötő domén feladata a poliszacharid szerkezetének fellazítása, a láncok hozzáférhetővé tétele és ezt követően a katalitikus egységnek a cellulózhoz kötése. A katalitikus aktivitással rendelkező modul feladata pedig a glikozidos kötés hidrolizise. A Clostridium thermocellumbaktérium cellulózbontó enzimei, mint pl. a glikozid-hidrolázok egy cellulóz-kötő fehérjén keresztül kapcsolódnak a polimerhez. Ezek a cellulózkötő és bontó enzimek a sejtfelszíni celluloszómában mintegy enzimkomplexet alkotnak.

Az endoglukonázok, vagy 1,4-β-D-glukán-glukanohidrolázok a cellulóz polimer láncain belül véletlenszerűen bontják a kötéseket és hasítják a láncokat. Az így felszabadult nem redukáló láncvégekről aztán a cellobióz-hidrolázok egy molekula víz belépésével cellobióz egységeket hasítanak le, folyamatosan, egyiket a másik után.

Végezetül a cellobiáz, vagy más néven β-glükozidáz katalizálja a cellobióz monomerekre bontását. A β-glükozidáz, a hasítások révén keletkezett oligomerek nem redukáló végéről is glükóz egységeket távolít el.

A vízben oldhatatlan cellulózzal ellentétben, a jól oldódó glükóz - a sejt anyagcsere rendszerétől függően – az Emben-Meyerhof-Parnas-, a pentóz-foszfát- vagy az Entner Doudoroff-úton át eloxidálódhat, és energiaforrásként szolgálhat a baktérium számára. Aerob bontás esetén végezetül víz és szén-dioxid szabadul fel, míg anaerob feltételek mellett a fermentáció irányába futnak a folyamatok.

A cellulózbontás tehát nem kevés energiával szolgál, hiszen a cellulóz lánc általában 2000 – 15000, de esetenként akár 30000 glükóz egységet is tartalmazhat.

A természetben sok mikroorganizmus képes a cellulóz depolimerizálására. Közöttük mesofil és termofil szervezetek, valamint anaerob és aerob mikrobák egyaránt megtalálhatók. Anaerob hidrolizálók például aClostridium omelianskii,

a termofilClostridium thermocellum, valamint a kérődzők bendőjében találhatóFibrobacterés Ruminococcus fajok. Az aerob bontók közül példaként aCellvibrio gilvus,Cellvibrio ochraceus, aCellfacicula viridis, aSporophaga myxococcoidesés aCellulomonasspp. baktérium fajokat, valamint azAgaricus, Aspergillus, Fusarium, Penicillium ésTrichodermagomba nemzetségeket említhetnénk.

Bakteriális és gomba eredetű celluláz enzimeket az iparban is sokhelyütt alkalmaznak. Így például az élelmiszeriparban, ahol az olivaolaj préselésétől a gyümölcslé vagy sörgyártásig számos helyen alkalmaznak cellulázos kezelést. De hasonlóképpen fontos a takarmánygyártásban is. Ezekben az esetekben a használatos β-glükanázok baktériumoktól (Bacillussp.) és gombáktól is (Trichodermasp.,Aspergillussp.) származhatnak. A textil és papíripari cellulázok azonban főként Trichoderma sp. ésAspergillussp. eredetűek.

Hemicellulóz bontása

A hemicellulózok – a cellulóz mikrofibrilláikhoz hidrogén- vagy van der Waal’s kötésekkel kapcsolódnak, – és a növényi sejtfalban a pektinnel együtt alkotják azt a mátrixot, melybe a cellulóz beágyazódik.

A hemicellulóz elnevezés gyűjtőfogalom, amelybe többféle poliszacharid tartozik, és amelyeket - a cellulózzal ellentétben – legtöbbször különböző monomer építőegységek és/vagy különböző kötési típusok jellemeznek.

Összetevői között a glükóz mellett megjelenik az arabinóz, a galaktóz, a mannóz, a ramnóz, és a xilóz, de tartalmazhat még további komponenseket is. Az öt és hat szénatomos cukorkomponensek aránya és kapcsolódási sorrendje a hemicellulóz származásától (pl. a növényfajtól), típusától függően változik. A polimerizációs foka, a felépítő egységeinek száma azonban a cellulózénál kisebb, és termikusan is jóval instabilabbak.

A szerkezetüket tekintve igen heterogén hemicellulózok több csoportra oszthatók: ide tartoznak a vegyes kötésű glükánok, a xiloglükánok, a xilánok, és a mannánok.

A vegyes kötésűglükánokalapegységeiket tekintve - a cellulózhoz hasonlóan - D-glükóz monomerekből állnak, de itt a β-1-4 kötések mellett a β-1-3 kötések is megjelennek. Az 1-3 kötések nagy számából adódóan a glükán a cellulóznál nyitottabb szerkezetű és könnyebben hidrolizálható.

Axiloglükánok már nehezebben bonthatók. A molekula gerincét ugyan itt is D-glükóz egységek alkotják, de köztük kizárólag β-1-4-glikozidos-kötések vannak, és az alaplánc glükóz egységeinek mintegy feléhez β-1-6-kötéssel xilóz molekulák kapcsolódnak. Ez utóbbiakhoz még további galaktóz és fukóz molekulák kötődhetnek, és így többszörösen elágazó szerkezetet képeznek.

Axilánokalkotják a hemicellulózok talán legnagyobb csoportját. Vázukat β-1-4-, az elágazásoknál pedig ß-1-3-D-xilozidos kötésekkel kapcsolódó D-xilóz molekulák alkotják. Ezzel a kizárólag D-xilóz tartalmú homopolimer formával azonban csak ritkán (pl. dohány esetében) találkozhatunk. Az alaplánchoz ugyanis legtöbbször még további egységek kapcsolódnak. Így a D-xilóz 2-es és 3-as szénatomjának hidroxil csoportjait acetilcsoportok észteresítik. Oligoszacharid oldalláncaik pedig – aszerint, hogy arabinoxilánokról, vagy metil-glükoronoxilánokról van szó - különböző összetételűek lehetnek. Így D-glükuronsavat, 4-o-metil-D-glükuronsavat, arabinózt, L-arabinofuranózt, D-galaktózt, D-glükózt, L-ramnózt és ferulasavat is tartalmazhatnak.

A xilán összetételének megfelelően a bontó enzimek is sokfélék. Az endo-1,4- és az endo-1,3-ß-xylanase az alapváz β-1-4-, és ß-1-3-D-xilozidos kötéseit hidrolizálja, míg az exo- β-1-4- és β-1-3-xylosidase a β-1-4- és β-1-3-xilán nem redukáló végéről hasít le D-xilóz egységeket. Az α-L-arabinofuranosidase az α-1-3- és/vagy α-1-5-kötésekkel kapcsolódó L-arabinofuranozid végeket hidrolizálja, míg az acetil-észteráz aktivitása az acetil kötések hidrolízise révén alkohol és ecetsav képződéséhez vezet.

Amannánokszerkezetének alapját a ß-1-4-kötésekkel kapcsolódó D-mannóz egységek alkotják, amihez néha még ß-1-6-kötésekkel is társulhatnak D-mannóz molekulák.

Ehhez az alaphoz ß-1-4 kötéssel glükóz és galaktóz, valamint ß-1-6- ill. β-1-3-kötésekkel xilóz és D-arabinóz kapcsolódhat. Ha a mannánhoz kb. 25%-ban D-glükóz vagy D-galaktóz kötődik, akkor a hemicellulóz molekula szerkezetet az előbbi esetben glükomannánnak, az utóbbiban galaktomannánnak nevezzük.

Ennek megfelelően a mannánokat bontó enzimek közül endo-1-4-ß-mannozidáz ß-1-4-D-mannozidos kötéseket a mannán, galaktomannán és a glükomannán belső részein hidrolizálja, míg az exo-ß-1-4-mannobiohidroláz a mannán nem redukáló végéről hasít le mannobióz egységeket. Az endo-mannozidáz pedig a mannán ß-1-6-D-mannozidos kötéseit hidrolizálja.

A hemicellulózok tehát egyszerű cukrokká bonthatók, amelyek aztán jól hasznosíthatók a sejt katabolikus anyagcseréjében. A hemicellulózt bontó szervezetek közé tartoznak pl.Bacillus subtilis, Bacillus megatherium, Aspergillus niger, Aspergillus favus,valamint aTrichodermanemzetség tagjai.

A hemicellulóz fermentálható egységekre bontása fontos kutatási területe pl. a fa-és egyéb növényi anyagok lebontásán és hasznosításán (pl. bioetanol gyártás) alapuló ipari technológiák kidolgozásának.

Pektin bontás

A növényi sejtfalban a hemicellulózok a pektinnel együtt alkotják azt a mátrixot, melybe a cellulóz beágyazódik.

A pektin is rendkívül változatos felépítésű poliszacharid. Szerkezetük alapján a pektinben három csoportot (egységet) különböztethetünk meg

A homogalakturonát α-1,4-glikozidos kötésekkel kapcsolódó D-galakturonsav molekulák alkotta lineáris homopolimer (7.2/8. ábra).

7.2/8. ábra. A homogalakturonát szerkezete

A ramnogalakturonát I. vázát a ramnóz és galakturonsav molekulák váltakozva építik fel, amihez még α-1,5-L-arabinóz és β-1,4-D-galaktóz monoszacharidok kapcsolódnak (7.2/9. ábra).

7.2/9. ábra. A ramnogalakturonát I. szerkezete

Ramnogalakturonát II. pedig még összetettebb felépítésű. A fő vázat itt 8-10 galakturonsav egység alkotja, amelyhez 12 különböző fajta cukor, illetve ezek homo- és hetero-oligomerjei rendkívül változatos kötésekkel kapcsolódnak (7.2/10. ábra).

7.2/10. ábra. A ramnogalakturonát II. szerkezete

A pektinláncon belül e három forma változó arányokban lelhető. Ennek a rendkívül összetett hetero-poliszacharidnak a bontására meglehetősen sok mikróba képes. A baktériumok közül aBacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus polymyxafajokat, míg a gombáknál azAspergillus, Botrytis, PenicilliumésRhizopusnemzetség tagjait, emelhetnénk ki példaként. A növényi kózokozók egy csoportjának, így például azErwinia carotovora, Clostridium acetobutylicum és Clostridium puniceumfajoknak fontos virulencia tényezője a pektinbontás képessége, a pektináz enzimek termelése.

A pektin bontását végző enzimek három fő csoportba – a pektinészterázok, a hidrolázok és a liázok közé - sorolhatók aszerint, hogy milyen típusú kötéseket hasítanak. A pektinészterázok a galakturonsav molekulák metilészter-csoportját random módon hasítják le. A hidrolázok a poligalakturonsav alfa-1,4-glükozidos kötéseit hasítják: az endo-poli-galakturonáz és –poli-metil-galakturonáz véletlenszerűen, míg az exo-poli-galakturonáz és exo–poli-metil-galakturonáz a láncvégeken hasít.

A liázok az alfa-1,4-glükozidos kötés hasítását katalizálják (transz-eliminációval). Ennek során a nem redukáló láncvégen levő galakturonsav, vagy galakturonsav-metilészter 4. és 5. szénatomja között egy kettős kötés képződik (7.2/11. ábra).

7.2/11. ábra. A pektinészteráz, poligalakturonáz és pektin liáz enzimek bontási mechanizmusa A pektin sok mikroorganizmus számára egyedüli szén- és energiaforrásként szolgálhat. Ezek a szervezetek a D-galakturonsavat pl. D-xilózzá alakítják, ami aztán a pentóz-foszfát úton keresztül hasznosulhat és kapcsolódhat be a sejt katabolikus folyamataiba.

A pektinázok ipari felhasználása is igen széleskörű. A savas pH tartományban működő pektinbontó enzimeket a textiliparban (pamut, len, kender kikészítésénél), és a gyümölcsfeldolgozás területén, míg az alkálikus pektinázokat főképp a papíriparban, valamint kávé és tea feldolgozásánál hasznosítják.