Nitrogén fixáció

A biológiai nitrogén fixáció a nitrogén körforgalom egyik legfontosabb folyamata, hiszen az egész földi bioszféra nitrogén szükségletének ez az egyik fő forrása. Becslések szerint évente körülbelül 2,2 x 10¹¹kg (a terresztrikus ökoszisztémákban 1,4 x 10¹¹kg, míg a tengeri ökoszisztémákban 0,8 x 10¹¹kg) nitrogén biológiai fixációjára kerül sor.

A légköri nitrogéngáz megkötésére kizárólag prokarióta szervezetek (Bacteria és Archaea) képesek, melyek lehetnek szabadon élő vagy növényekkel asszociált (szimbionta) mikroorganizmusok. A szimbionta kapcsolatban élő nitrogénfixáló szervezetek közül a pillangós virágú növényekkel gyökérgümő kialakítására képes baktériumok a legismertebbek, melyek az Alphaproteobacteria osztály két leszármazási ágán (az egyikben aBradyrhizobiumés az Azorhizobium, a másikban a Rhizobium, a Sinorhizobium és a Mesorhizobium nemzetségek), és a Betaproteobacteria osztály Burkholderia és Ralstonia nemzetségében találhatók. A Frankia nemzetség (Actinobacteria) képviselői különféle kétszikű növényekkel képesek szimbionta kapcsolat kialakítására. A Nostocaceae családba tartozó fonalas cianobaktériumok egyes becslések szerint 150 különféle növényfajjal, beleértve a cikászféléket, azAzollavízipáfrányt, vagy a kétszikűGunnera-t, képeznek asszociatív szimbiózist.

Egyes nitrogén fixáló baktériumok (pl. az Azospirillum vagy a Herbaspirillumfajok) lazább, ún. asszociatív szimbiózist képeznek különféle gazdanövényekkel (pl. rizzsel, búzával, cukornáddal). Bár ezek a baktériumok is jelentősen hozzájárulnak a gazdanövény nitrogén ellátásához, nitrogénfixációs aktivitásuk elmarad a szimbionta diaztotróf szervezetekétől.

Az általános vélekedés szerint a nitrogénfixálókkal kialakított interakció az állatok körében kevésbé jelentős, mint a növényeknél, ami azzal magyarázható, hogy az állatok csak korlátozott mennyiségben képesek a nitrogénfixáció elsődleges termékének, az ammóniának a hasznosítására. Az ammónia ugyanis a legtöbb állat esetében potenciálisan toxikus anyagcsere végtermék. Ennek ellenére nitrogénkötő baktériumok előfordulnak számos állat normál bélmikrobiótájában, de abundanciájuk általában kicsi, és jelentőségük a gazdaszervezet szempontjából

elhanyagolható. Kivételt képeznek ez alól a nitrogénben szegény fakorhadékot fogyasztó állatok (pl. bizonyos termeszek és a gyászbogár lárvák), melyek nitrogén szükségletük kielégítésére szimbionta kapcsolatot hoznak létre nitrogénfixáló baktériumokkal.

Bár a nitrogénfixációhoz szükséges nif struktúrgének meglehetősen konzervatívok, a nitrogénfixációra képes prokarióták taxonómiai, filogenetikai és anyagcsere szempontból is meglehetősen változatosak. Közülük egyesek különleges környezetekben élő, ún. extremofil szervezetek. Nitrogénfixációt kimutattak már 0°C alatti hőmérsékleten és a víz forráspontjának közelében 92°C-on csakúgy, mint pH 2 és pH 10 értékeken, ami arra utal, hogy a nitrogénfixáló baktériumok a környezeti tényezők széles skálájához képesek alkalmazkodni.

Az elemi nitrogénnek ammóniává történő redukcióját a nitrogenáz enzimkomplex katalizálja. A folyamat során protonoknak hidrogénné történő redukciója is végbemegy, de a nitrogenáz enzimkomplex más kettős vagy hármas kötést tartalmazó vegyület (pl. az acetilén, vagy a cianid) redukálására is képes. A nitrogénfixációra képes prokariótákban négyféle nitrogenáz ismert, amiből három egymáshoz hasonló (Mo, V és Fe tartalmú nitrogenáz), míg a Streptomyces thermoautotrophicus baktériumfajban egy különleges nitrogenáz található. Valamennyi diazotrófban (nitrogénfixálóban) molibdén tartalmú nitrogenáz fordul elő vagy kizárólagosan (Klebsiella és Rhizobium), vagy más alternatív nitrogenázokkal együtt (pl. az Azotobacter chroococcumMo és V tartalmú nitrogenázokkal, aRhodobacter capsulatusMo és Fe tartalmú nitrogenázokkal, azAzotobacter vinelandiimindhárom enzimmel rendelkezik). A három hasonló szerkezetű nitrogenáz enzimkomplex feltehetően közös őstől származik, és két metalloproteinből (a MoFe, VFe vagy FeFe tartalmú dinitrogenázból és a Fe tartalmú dinitrogenáz-reduktázból) áll.

A molibdént tartalmazó nitrogenáz enzim és kofaktorainak bioszintézise, az elektronszállítás és a szabályozás több mint 20nifgén bevonásával történik (7.1/8. ábra). AnifDésnifKgének által kódolt, α₂β₂tetramer szerkezetű dinitrogenáz két pár szokatlan és egyedülálló fémtartalmú központot tartalmaz, a MoFe-kofaktort (Mo₁Fe₇S₉és homocitrát) és a P klasztert (Fe₈S₇), vagyis mindegyik tetramerben 2 Mo, 30 Fe és 32 S atom található. AnifH gén által kódolt reduktáz homodimer szerkezetű, központjában 4 Fe és 4 S atommal. A dinitrogenáz-reduktáz mindegyik alegységében található egy-egy Mg-ATP-kötő hely is.

7.1/8. ábra. A Klebsiella pneumoniae nif regulonjának felépítése

A dinitrogenáz enzim tartalmazza a N2redukció katalitikus helyét, míg a dinitrogenáz-reduktáz az elektrondonor a dinitrogenáz számára (7.1/9. ábra).

7.1/9. ábra. A nitrogenáz enzimkomplex szerkezete

A dinitrogenáz-reduktáz enzimre ezen kívül a dinitrogenáz enzim szintézise során is szükség van. A két enzimfehérje (MoFe és Fe protein) a nitrogén fixáció során komplexet képez. A katalitikus események sorozata két egymáshoz kapcsolódó ciklust foglal magába. A dinitrogenáz-reduktáz ciklusa az enzimkomplex kialakulását, a Fe proteinről a MoFe proteinre történő elektronszállítást, a Mg-ATP hidrolízist és az oxidált dinitrogenáz-reduktáznak a fiziológiás elektrondonorról (ferredoxinról vagy flavodoxinról) történő visszaredukálását, míg a dinitrogenáz ciklusa a szubsztrát redukciós lépéseket foglalja magába.

A nitrogén redukciójához szükséges elektronok rendszerint közvetlenül a flavodoxinról vagy a ferredoxinról kerülnek a dinitrogenáz-reduktázra. Ezeknek a kis redoxpotenciálú nem hem típusú Fe-S fehérjéknek a redukálását az adott prokarióta szervezet anyagcseréjétől függően biztosíthatja például a piruvát oxidatív dekarboxilációja acetil-koenzimA-vá. A dinitrogenáz-reduktáz enzim oxidációs-redukciós ciklusa során minden egyes elektron felvételekor 2 molekula Mg-ATP-t is megköt. A Mg-ATP-nek a dinitrogenáz-reduktázhoz való kötődése az enzim konformáció változását és redoxpotenciál értékének (-280 mV-ról -400 mV-ra) csökkenését eredményezi. Ez teszi lehetővé a dinitrogenáz-reduktáznak a dinitrogenázzal való kapcsolódását, majd ezt követően az elektronoknak a dinitrogenáz-reduktázról a dinitrogenázra történő átadását az ATP hidrolízise közben. A dinitrogenáz-reduktáz eközben disszociál a dinitrogenázról, és oxidációs-redukciós ciklusa újra kezdődik. A nitrogén redukciója ammóniává a redukált dinitrogenáz enzim FeMo-kofaktorának közreműködésével történik, szabad köztitermékek keletkezése nélkül. Az elemi nitrogén redukciója során az elektronok és az ATP egy része protonoknak hidrogénné történő redukciójára használódik fel, így a nitrogén fixáció során az ammónia képződése mellett számolni kell a hidrogénnek, mint mellékterméknek a keletkezésével is.

Az alternatív nitrogenázok, melyek molibdén hiányos körülmények között szintetizálódnak, a Mo helyett kofaktorként vanádiumot (V) vagy vasat tartalmaznak. Az alternatív nitrogenázok egyfajta biztonsági rendszerként funkcionálnak, hiszen korlátozott molibdén ellátottság esetén is lehetővé teszik a baktériumok számára a nitrogénfixációt. Az alternatív nitrogenáz enzimekben az α és a β alegységek mellett egy δ alegység is megtalálható, α₂β₂δ₂szerkezetet képezve.

A nitrogenáz enzimkomplex a molekuláris nitrogénen kívül egy sor másik a nitrogénhez hasonló méretű és konformációjú vegyület (pl. a hidrogén-cianid, a hidrogén-azid, a dinitrogén-oxid) redukcióját is képes katalizálni.

Mindezek a reakciók a nitrogén redukciójához hasonlóan energiaigényes folyamatok, beleértve a dinitrogén-oxid nitrogenáz enzimmel történő redukcióját is. Ez utóbbi folyamat azonban eltér a denitrifikáció során a dinitrogenáz-reduktáz által katalizált energiaszerző folyamattól, ami acetilénnel gátolható. Az 1960-as évek végén fedezték fel a kutatók, hogy a nitrogenáz az acetilént (C₂H₂) is tudja redukálni etilénné (C₂H₄), ami az enzimpreparátumoktól kezdve egészen a talajmintákban lévő nitrogenáz aktivitás kimutatásáig olcsó és egyszerű gázkromatográfiás detektálásra ad lehetőséget.

A nitrogén fixáció meglehetősen energiaigényes, ezért az adott szervezet számára rendelkezésre álló energia és redukálóképesség hozzáférhetősége gyakran a folyamat korlátozó tényezői. A nitrogén fixáció szabályozó elemei közé tartozik még az oxigén, mivel a nitrogenáz enzimkomplex különlegesen érzékeny az oxigén jelenlétére, és csak anoxikus körülmények között vagy nagyon kicsi oxigén parciális nyomás mellett aktív.

AzAzotobacterfajok nitrogenáz enzimkomplexe a dinitrogenáz-reduktázon és a dinitrogenázon kívül egy harmadik, ún. Shethna (FeS II) proteint is tartalmaz, ami ún. konformációs védelmet biztosít az enzimkomplexnek az oxigén inaktivációjával szemben. A legtöbb szabadon élő diazotróf szervezet azonban nem rendelkezik az oxigénnel szembeni specifikus védelmi mechanizmussal. Ezek a baktériumok csak akkor képesek nitrogént kötni, ha környezetükben az oxigénszint a normál atmoszférikus értéknek kevesebb, mint egy-huszada (≤ 25 μM). Ilyen mikroaerofil növekedésre képes szervezetek közé tartoznak például az Azospirillum, az Aquasprillum, a Magnetospirillumés aPseudomonasnemzetségek, továbbá a metanotrófok diazotróf képviselői, melyek gyakran kolonizálják különféle növények (pl. a rizs) rizoszféráját.

Egyes cianobaktériumok, mint például a fonalasAnabaenafajok általában minden 10. vagy 12. vegetatív sejtjük helyett egy heteroci(sz)tának nevezett, nitrogén fixációra specializált sejtet képeznek. Ezekből a sejtekből hiányzik a II. fotorendszer, így a heteroci(sz)tákban zajló fotoszintézis során nem keletkezik oxigén. Megvastagodott sejtfaluk pedig megakadályozza az oxigénnek a környezetből a sejtbe történő diffúzióját. Az Anabaena fajok vizes környezetekben szabadon élő és növény asszociált formában is fixálnak nitrogént. AzAnabaenaazollaepéldául a békalencsepáfrány (Azollaspp.) levelében hoz létre szimbionta kapcsolatot, és nitrogénkötése révén nagymértékben hozzájárul a rizsföldek nitrogénellátásához. Más fonalas cianobaktériumok, mint például aTrichodesmiumfajok nem képeznek heteroci(sz)tákat, de nitrogén fixációra képesek, mégpedig a telepeik belsejében lévő sejtekben, ahol nem folyik fotoszintézis. Az egysejtűGloeocapsafajok más stratégiát fejlesztettek ki, nappal fotoszintetizálnak, és éjjel fixálnak nitrogént.

A nitrogén fixáció folyamata az ammónia és az oxigén jelenlététől vagy hiányától függő, transzkripciós és poszttranszlációs szabályozás alatt áll (7.1/10. ábra). A szabadon élő nitrogénfixáló szervezetekben az ammónia jelenléte gátolja a nifgének átíródását. A szimbionta diazotrófok nitrogenáza rendszerint kevésbé érzékeny az ammónia jelenlétére, mert ez náluk nagyrészt a gazdanövény sejtjébe transzportálódik. A legtöbb nitrogénfixáló prokariótában anifstruktúrgének átírása anifLAregulátorgének szabályozása alatt áll, de léteznek más szabályozási módok is (pl. a heteroci(sz)tás cianobaktériumokban). AnifAgén terméke (NifA) egy olyan transzkripciós aktivátor, ami valamennyinifpromoter expressziójához szükséges. A NifL egy flavoproteint tartalmazó negatív regulátor, amelyik oxigén vagy fixált nitrogén jelenlétében a NifA-hoz kapcsolódik, és inaktiválja azt.

Az oxigén vagy az ammónia jelenlétére az anoxikus fototróf baktériumokban a nitrogenáz enzim aktivitásának poszttranszlációs szabályozása biztosít gyors és reverzibilis válaszlehetőséget. Ez a szabályozó mechanizmus a dinitrogenáz-reduktáz ADP-riboziltranszferáz (DraT) / dinitrogenáz-reduktáz aktiváló glikohidroláz (DraG) enzimrendszer közvetítésével az egyik dinitrogenáz-reduktáz fehérje alegység egy specifikus arginin maradékánál reverzibilis ADP-ribozilációt eredményez. Ammónia jelenlétében a DraT aktiválódik, és a NAD⁺-ról származó ADP-ribóznak a specifikus arginin maradékra történő áthelyezését katalizálja, ami megakadályozza a dinitrogenáz-reduktáznak a dinitrogenázzal való komplexképződését, és ezáltal a nitrogenáz inaktiválódásához vezet. Kis ammónia koncentráció esetén a DraG aktiválódik, ami eltávolítja az ADP-ribózt a dinitrogenáz-reduktázról, így ismét kialakulhat az aktív nitrogenáz enzimkomplex.

A nitrogén fixációt az ammónia egy másik fehérje, az NtrC segítségével gátolhatja. Ammónia limitált környezetben az NtrC fehérje aktív, és elősegíti a nifAgénen keresztül a nifstruktúrgének átíródását. A baktériumsejtben a nitrogenáz által szintetizált ammónia azonban nem gátolja a nitrogén fixációt, mivel a keletkező ammónia a bioszintetikus folyamatok során szinte azonnal beépül aminosavakba.

7.1/10. ábra. A nitrogén fixáció szabályozása

Az aerob nitrogénfixáló baktériumokban a hidrogén redukciójára használt elektronok visszanyerése céljából működik egy ún. felvételi hidrogenáz, melynek segítségével ezek a szervezetek képesek a nitrogén fixáció során keletkezett hidrogént visszaoxidálni, és az így felszabaduló elektronokat ATP szintézisre hasznosítani.

Szerkezetileg és működését tekintve is egyedülálló nitrogenáz enzimkomplex található a Streptomycesthermoautotrophicus(Actinobacteria) termofil (hőmérsékleti optimuma 65°C), Gram-pozitív, fonalas baktériumban. Ezt az aerob kemolitotróf autotróf anyagcserét folytató mikroorganizmust eddig csak faszénégető halmok belsejéből izolálták. Hidrogénoxidáló szervezet, amelyik elektrondonorként a szénmonoxidot (CO) is képes elfogadni. AS. thermoautotrophicusnitrogenáza a többi nitrogenázhoz hasonlóan molibdént tartalmaz, de azoktól eltérően nem érzékeny az oxigén jelenlétére. Ez az egyedülálló sajátosság a S. thermoautotrophicus különleges anyagcseréjével magyarázható. A baktériumban egy (molibdén tartalmú) szén-monoxid-dehidrogenáz enzim által közvetített reakcióban (a szén-monoxidnak szén-dioxiddá történő oxidációja során, egyidejűleg az oxigén szuperoxiddá történő redukciójával) kerülnek a nitrogén fixációhoz szükséges elektronok a nitrogenáz enzimre (7.1/11. ábra).

7.1/11. ábra. A Streptomyces thermoautotrophicus nitrogén fixációja

AS.thermoautotrophicus nitrogenáz enzimkomplexe is két részből áll: egy αδγ heterotrimer szerkezetű MoFeS proteinből (Str1) és egy a klasszikus nitrogenázban található Fe proteint helyettesítő Mn tartalmú szuperoxid-oxidoreduktázból (Str2), ami a szuperoxid aniont (O₂^-) oxidálja oxigénné, és ezáltal elektront biztosít a MoFeS protein számára. Az Str2 nagyfokú hasonlóságot mutat a sejtek toxikus oxigén gyökökkel szembeni védelmében szerepet játszó szuperoxid-diszmutáz enzimmel. A Str2 enzim által katalizált reakciót tekintve érthető tehát, hogy aS.thermoautotrophicusnitrogenáza nemcsak hogy érzéketlen az oxigén jelenlétére, hanem kifejezetten igényli is annak jelenlétét. Ezzel a tulajdonságával magyarázható az is, hogy a többi nitrogenázhoz képest kevesebb, mindössze 25-50%-nyi ATP-t igényel az általa katalizált reakció.