Az L-típusú kalcium-csatornára vonatkozó kísérleti eredmények

Az ioncsatornákon keresztül folyó áram mérésére az egyik legfontosabb mód-szer a „patch-clamp” technika [42]. Ez egy elektrofiziológiai kísérleti módmód-szer, amely elsősorban elektromosan ingerelhető sejtmembránban elhelyezkedő ioncsator-nák tanulmányozására alkalmas. Egy üveg mikropipettát illesztenek a sejtmembrán-hoz, amelyben egy elektróda helyezkedik el. Az elrendezéstől függően (4.2.1. ábra) a pipettát aztán leszakítják a sejtről a rajta levő membrándarabbal (így lehetővé téve az egyetlen ioncsatornán keresztül folyó áram mérését), vagy szívással beszakítják a pipetta végén lévő foltot. Ez utóbbi a „whole cell” mérés, amikor a teljes sejtmemb-ránon lévő ioncsatornákon keresztül folyó áramot mérik. A következőkben bemuta-tásra kerülő kísérletek ilyen technikával lettek végrehajtva. A „patch clamp” technika kifejlesztéséért Neher és Sakmann 1991-ben Nobel díjat kaptak.

4.2.1. ábra

A „patch clamp” technika folyamata (forrás: http://en.wikipedia.org/wiki/Patch_clamp)

Az L-típusú kalciumcsatorna rendkívül szelektív kalciumionra a monovalens ionokkal (Na⁺, K⁺) szemben. Erre (mások mellett) egy klasszikus elektrofiziológiai kísérlet enged következtetni. Almers és McCleskey fokozatosan kalciumot adagoltak a sejten kívüli térrészbe, miközben a háttérben lévő NaCl koncentrációját 33 mM

értéken tartották (4.2.2. ábra). Azt találták, hogy a kalcium adagolásával a csatornán átfolyó áram gyorsan csökken, mikromólos kalcium koncentrációnál a felére (azt a kalcium-koncentrációt, amelynél az áram a kalciummentes esethez képest a felére csökken hagyományosan IC50-nel jelölik, és ezzel jellemzik a csatorna szelektivitá-sát), majd még kisebb értékekre: a kalciummentes áramerősség körülbelül 10 %-ára.

A kalciumion tehát blokkolja a nátriumionok áramát [43; 44]. Ez arra enged követ-keztetni, hogy létezik a pórus mentén egy kalcium kötőhely, ahova kalciumion kötő-dik be és megakadályozza a nátriumionok áramát.

4.2.2. ábra

Az Almers és munkatársai kísérlete a nátriumáram kalcium-blokkjára: 33 mM-os NaCl-hoz CaCl2-ot adagoltak a sejten kívüli térrészbe. Az ábra a normalizált áramot mutatja a rendszerhez adagolt

CaCl2 koncentrációjának függvényében [43].

Ez a kötőhely (illetve a legfontosabb ilyen kötőhely) minden bizonnyal a sze-lektív szűrő. A szesze-lektív szűrő a legkisebb átmérőjű része a pórusnak egy jól megha-tározott szerkezettel. Itt dől el, hogy az ioncsatorna melyik ionra lesz szelektív. A KcsA káliumcsatorna esetében ismert, hogy a szelektív szűrőt a peptidláncon elhe-lyezkedő karbonil oxigének határolják. Az oldalláncok a fehérje belsejében helyez-kednek el. A kalciumcsatorna esetében viszont ezzel szemben azt feltételezik, hogy az oldalláncok a csatorna belseje felé irányulnak (4.2.3. ábra).

4.2.3. ábra

Feltételezések szerint a kalciumcsatornák és a káliumcsatornák szelektív szűrői alapvetően különböz-nek egymástól. Míg a kalciumcsatornákban az aminosav oldalláncok a szűrő belseje felé állnak, addig

a káliumcsatorna szűrőjét a karbonil oxigének határolják [45].

Mivel közvetlen röntgendiffrakciós mérés kalciumcsatorna szerkezetére nem áll rendelkezésre, a szűrőben lévő oldalláncokat közvetve, génmutációs kísérletekkel határozták meg a következőképpen. Az aminosav szekvencia különböző aminosavait pontmutációs kísérletekkel megváltoztatták (általában az alaninnal helyettesítették, ami kicsi és töltetlen), és megmérték, hogy az így előállított ioncsatornának mikép-pen változtak meg a szelektivitási tulajdonságai.

4.2.4. ábra

Az L-típusú kalciumcsatornát négy peptidlánc alkotja. A szelektív szűrőt ennek a négy láncnak egy-egy leágazása határolja (P-loop). Az ábra ezeknek az elágazásoknak a szekvenciáját mutatja. A szűrőt

közvetlenül határoló glutaminsavak külön meg vannak jelölve (393, 736, 1145, 1446) [45].

Azt találták, hogy a szekvencia 393, 736, 1145, 1446 jelű glutaminsavait (E) (4.2.4. ábra) megváltoztatva jelentős változás mutatkozik a csatorna szelektivitásá-ban.

A megfelelő kísérlet a 4.2.4. ábrán látható Ellinor és munkatársai eredményei alapján [45]. Látható, hogy a glutaminsavat valami másra cserélve – a nála rövidebb de még mindig töltött aszparaginsavra (D), szintén nagyméretű, de töltetlen és polá-ros glutamátra (Q), illetve a kicsi és nem polápolá-ros alaninra (A) – a szelektivitás a mikromólosról nagyságrendekkel változik (4.2.5. ábra). Napjainkban teljesen elfo-gadott, hogy kalciumcsatornák szelektív szűrőjében négy, negatívan töltött COO^- csoport helyezkedik el. Ez a karboxilban gazdag környezet nem csak a kalciumcsa-tornák szelektív szűrőjének sajátja, hanem a kalciumkötő fehérjék (pl. calmodulin) kötőhelyének is. Ezekről viszont számos röntgenszerkezettel rendelkezünk. [46].

Ezen kívül különböző kalciumkötő komplexképző vegyületek (EDTA, EGTA) kötő-helye is egy karboxilban dús tartomány.

4.2.5. ábra

Ha a 4.2.4. ábrán látható glutaminsavakat (E) külön-külön pontmutációs kísérletekkel más (D, Q vagy A) aminosavakra változtatjuk, a csatorna kalcium-szelektivitása (IC50) erőteljesen megváltozik

[45].

Annak, hogy a karboxilban gazdag szűrő egy kalcium-szelektív csatornát eredményez, egy közvetlen bizonyítéka az ismert Heinemann kísérlet [47]. Ebben a

kísérletben a nátriumcsatorna szelektív szűrőjében a jellemző DEKA szekvenciában a pozitív lizint (K) egy negatív glutaminsavra (E) cserélték pontmutációs kísérlettel (DEKA → DEEA). Ezen mutáció során a DEKA nátriumcsatorna a kalciumcsator-nák szelektivitási tulajdonságaival bíró csatornává változik. A 4.2.6. ábra mutatja a csatornán átfolyó áramot a kalcium adagolása függvényében. Látható, hogy a görbe az Almers és McCleskey kísérletben kapott görbéhez hasonló azzal az eltéréssel, hogy 10^-6 M-os szelektivitás helyett 10^-4 M-os szelektivitást kaptak. Ez nem megle-pő, hiszen a csatorna töltése -3e a -4e helyett. (lásd az A-val való helyettesítést az Ellinor-kísérletben, 4.2.5. ábra).

4.2.6. ábra

Ha a feszültség-vezérelt nátriumcsatorna szelektív szűrőjében a pozitív lizint (K) egy negatív gluta-minra (E) cseréljük (tehát a DEKA szekvenciát DEEA szekvenciára változtatjuk), akkor kalcium

ada-golásával egy kalciumcsatornára jellemző görbét kapunk. A kalciumblokk (IC50) 10^-4 M-nál jelenik meg [47]

Az irodalomban rendelkezésre álló kísérletek főként a divalens és monovalens ionok (illetve azonos töltésű, de különböző méretű ionok) versengésére vonatkoznak, trivalens ion részvételével végrehajtott szelektivitási mérés azonban kevés van az irodalomban [48 - 53]. Az egyik kivétel a Babich és munkatársai által elvégzett kutatás [53; 54]. Arra közöltek mérési eredményeket, hogyan változik az L-típusú kalcium-csatornán átfolyó áram, ha 150 mM NaCl-hoz és 10mM divalens-sóhoz (CaCl2, BaCl2, és SrCl2) gadolíniumot (GdCl3) adagolnak.

Az IC50 ezekben a kísérletekben nehezen értelmezhető. Azt találták, hogy a csatornára egy feszültségimpulzust adva (ez kinyitja a csatornákat) az áram

fokoza-tosan csökken az idő függvényében. Stacionárius állapot kialakulásának nem találták jelét. Az áram csökkenésének kétféle oka lehet. (1) Egyre több Gd³⁺ diffundál a csa-tornák (ne feledjük, „whole cell” kísérletről van szó) közelébe, és egyre több csator-na blokkol, így a nettó áram csökken. (2) Az idő múlásával a csatornák inaktiválódnak. A Gd³⁺ Babich és munkatársai feltételezése szerint az inaktivációra is hatással van. Nem világos tehát, hogy a Gd³⁺ koncentráció változása milyen arányban befolyásolja az áramot a permeációs út blokkja, illetve a csatornák inaktivációja révén. Stacionárius mérési eredmények hiányában direkt összehasonlí-tás a számíösszehasonlí-tási eredményeinkkel tehát nem lehetséges.

Indirekt (kvalitatív) összehasonlításra azonban van mód. A Gd³⁺-blokkot Babich és munkatársai többféleképpen értelmezték. Egy feszültségimpulzus kezdetén az áramcsúcs nagysága (I1) csökken a Gd³⁺ adagolásával. Ezt „tonic” blokknak ne-vezték (lásd 4.2.7 ábra). Ez a blokk azt mutatja, hogy mennyi Gd³⁺ volt bekötve a zárt csatornákban rögtön a nyitás (a feszültségimpulzus eleje) előtt. Ezen túl definiál-ták az ún. „use-dependent” blokkot, ami a következőképpen áll elő. Az első impulzus után kis idővel egy másik impulzust adtak a membránra, és mérték az áramcsúcsot (I2). Az I2/I1 aránya adja a „use-dependent” blokkot, és azt jellemzi, hogy milyen gyorsan cseng le az áram a nyitás után. Az I2/I1 arány [Gd³⁺]-függése (Fig. 1F Babich és munkatársai cikkjében, 53) hasonló jellegű, mint az I1 [Gd³⁺]-függése (4.2.7. áb-ra).

Ha feltesszük, hogy a nyitás előtt a megkötött Gd³⁺ ionok aránya a szelektív szűrő [Gd³⁺]-affinitására jellemző, számítási eredményeink (ahol valójában ezt az affinitást számoljuk) a „tonic” blokkal összevethetőek. Azért is választottuk ezt a lehetőséget, mivel a „tonic” blokkra több kísérleti eredmény áll rendelkezésre.

Babich és munkatársai azt állítják, hogy a gadolínium a felelős a blokkért az-által, hogy egy kötőhelyhez kötődik a szelektív sűrőn kívül. Szerintünk ez a kötőhely akkor férhető hozzá, amikor a csatorna zárva van. Ekkor a gadolínium és a többi ion versenyeznek ezért a helyért (amire a Gd³⁺-nak van a nagyobb esélye. Ezzel szemben mi azt javasoltuk az ebben a témában megjelent publikációnkban [55], hogy nincs szükség a szelektív szűrőn kívüli kötőhely koncepciójára: maga a szelektív szűrő az a kötőhely, ahol a Gd³⁺ a másik két ion áramát blokkolja.

4.2.7. ábra

Babich és munkatársai kísérletében GdCl3-ot adagoltak fokozatosan 150 mM-os NaCl és valamilyen 10 mM-os divalens-só elegyéhez a sejten kívüli térrészbe. Az ábra az úgynevezett „tonic” blokkot ábrázolja (lásd szöveg) különböző divalens-sók esetére. A négyzet egy mutánsra vonatkozó

eredmé-nyeket mutatja, ahol az egyik glutaminsavat glutamátra cserélték [53].

A következő fejezetben ismertetem annak a kutatócsoportnak az eredményeit, amely a fent vázolt kísérletek (és még ezek mellett sok egyéb kísérlet) értelmezésére és kvalitatív reprodukálására törekedett az elmúlt tíz évben. Ennek a kutatócsoport-nak az a „munkafilozófiája”, hogy komplex fizikai jelenségek (például az L-típusú kalciumcsatorna szelektivitási tulajdonságai) megértéséhez közelebb jutunk, ha előbb egyszerűbb modelleket alkotunk a rendszerre, és megtaláljuk azokat a fő fizikai erő-ket, amelyek a rendszer viselkedését első rendben meghatározzák. A modell finomí-tása ezután lépésről lépésre történik.

A dolgozat fennmaradó részében a fent ismertetett kísérletek közül az Almers és McCleskey [43; 44] kísérlet (divalens - monovalens verseny, 4.2.2. ábra) és a Babich és munkatársai [53; 54] kísérlet (trivalens - divalens - monovalens verseny, 4.2.7. ábra) apropóján különböző töltésű ionok versengésére koncentrálunk.