Az ioncsatornás szimulációk történeti áttekintése

A statisztikus mechanikai számítások, és a különféle számítógépes szimuláci-ók mindig csak valamilyen jól definiált modellre végezhetők el [56; 57]. Minél egy-szerűbb ez a modell, annál könnyebben vizsgálható. A modell részletességét és a vizsgálatára használt módszert mindig meghatározzák annak a rendszernek a tulaj-donságai, amit vizsgálunk. Jelen esetben az ioncsatornára vonatkozó egyszerűsített, úgynevezett redukált modellel kell dolgoznunk, mivel a kalciumcsatornára részletes, háromdimenziós szerkezet nem ismert. Ebbe a redukált modellbe csak minimális szerkezeti információt foglalunk bele. A szelektivitási mechanizmus lényege, hogy a szelektív szűrőben -4 töltés egy kis helyre van összezsúfolva. Modelleznünk kell hát a csatorna fala által kifejtett rendkívül erős szerkezeti kényszert, amely ezeket az egymást taszító negatív oldalláncokat egy helyen tartja. Modelleznünk kell továbbá ezeknek az oldalláncoknak a két legfontosabb tulajdonságát: a töltésüket, valamint hogy véges helyet foglalnak el, és így a szűrőt rendkívül zsúfolttá teszik.

A modellünk és az ennek vizsgálatára használt szimulációs technika kifejlesz-tése egy 2000-ben kezdődött kutatási folyamat eredménye. 2000-ben Nonner és Eisenberg javasolták a CSC („charge-space competition”) mechanizmust (bár ezt a nevet csak Boda és munkatársai publikációjában [58] kapta), amit akkor még csak egy tömbfázisú MSA módszerrel vizsgáltak, az ioncsatorna szűrőjét pedig egy tömb-fázisú ioncserélővel modellezték [37]. A CSC mechanizmus tulajdonképpen az ellen-töltés által a szűrőben vonzott ionok között a szűkösen rendelkezésre álló helyért való versengést jelenti.

A mechanizmust jól szemléltethetjük, ha vesszük a szabadenergiát.

TS U

F   . (4.3.1)

A versengő ionok adott tömbfázisbeli koncentrációja mellett az az ioneloszlás fog kialakulni a szelektív szűrőben, amely a szabadenergiát minimalizálja. Ha az ionok hozzávetőlegesen azonos méretűek, vagyis azonos térfogatot foglalnak el a szűrőben, viszont a töltésük különböző (Na⁺ és Ca²⁺), akkor a divalens ion kétszer annyi töltést szolgáltat a monovalenshez képest a szűrő negatív töltésének semlegesí-tésére. A kalciumion tehát nagyobb mértékben csökkenti az energiát (U) anélkül, hogy az entrópiát ( ) túlságosan csökkentené (a S TS tagot növelné). Azonos tölté-sű, de különböző méretű ionok (Na⁺ és K⁺) esetén a kisebb van előnyben, mert

ki-sebb térfogatot foglal el a szűrőben. A kiki-sebb ion tehát változatlan U mellett kevésbé csökkenti az entrópiát. Kimondható tehát, hogy a nagyobb valenciájú és kisebb mére-tű ionok hatékonyabban tudják semlegesíteni a szelektív szűrő töltését.

Ugyanebben az évben kezdődtek az MC vizsgálatok, melyek során Henderson, Boda és munkatársai az ioncsatorna egy kezdetleges modelljével vizsgál-ták ezt a jelenséget, de már inhomogén körülmények között [58; 59].

Később kifejlesztettek egy realisztikusabb modellt, amelyben a csatorna már egy membránban helyezkedik el [60]. Ezt a modellt alkalmazták nátriumcsatornák vizsgálatára is, amely abban különbözik a kalciumcsatornától, hogy a szelektív szű-rőjében DEKA aminosavak (aszparaginsav: -1e, glutaminsav: -1e, lizin:+1e, alanin:

semleges) találhatóak a 4 glutaminsav helyett [61]. Ezek a szimulációk még kanoni-kus sokaságon folytak, azaz a csatorna szelektív szűrője az ugyanabban a szimuláci-ós cellában lévő tömbfázisú elektrolittal volt egyensúlyban. A szimulációk gyorsabb konvergenciája érdekében itt már egy súlyozott mintavételezési technikát alkalmaz-tak, amelyben preferenciálisan cserélték az ionokat a tömbfázis és a csatorna között (lásd 4.5 fejezet).

Ez a modell még viszonylag gyenge kalcium-szelektivitással rendelkezett, mivel a dielektromos együttható ugyanakkora volt mindenhol a szimulációs cellában, tehát a fehérjében is. Nyilvánvaló volt, hogy az erős kísérleti kalcium-affinitás repro-dukálásához figyelembe kell venni a csatornában levő eltérő polarizációs viszonyo-kat, azaz hogy a Coulomb kölcsönhatások a csatornában kevésbé árnyékoltak (erő-sebbek). Ezt a kontinuum szintű modellezés keretein belül úgy lehetett megvalósíta-ni, hogy a fehérje belsejének egy az oldatétól eltérő dielektromos együtthatót adtak.

Az így megjelenő dielektromos határfelületek, illetve az azon indukálódó polarizáci-ós töltések számítása viszont távolról sem triviális probléma, mivel az elektrosztati-kus kölcsönhatások így már nem páronként additívak.

A probléma megoldására kifejlesztették az úgy nevezett ICC („induced charge computation”) módszert [62], amit a 4.6 fejezetben ismertetek. Ez lehetővé tette, hogy egy továbbfejlesztett csatornamodellt használjanak, és ezt használjuk mi is vizsgálataink során. Ez a modell már képes volt produkálni a -os Ca²⁺ versus 30 -os Na⁺ szelektivitást, viszont ennek vizsgálatára már elégtelennek bizonyult a kanonikus sokaság.

M mM

A 2006-ban megjelent publikációban már nagykanonikus sokaságon vizsgál-ták a fehérje dielektromos együtthatójának hatását a szelektivitásra [63]. Azt találvizsgál-ták,

hogy minél kisebb ez a dielektromos együttható, annál erősebb a kalcium-szelektivitás. Ennek az a magyarázata, hogy a polarizációs töltések indukálásához munkát kell végezni, a rendszer tehát igyekszik egy olyan egyensúlyi állapotba be-állni, amelyben az indukált töltések nagysága minimális. Ezt úgy lehet elérni, ha a szelektív szűrő még több kationt vonz magához, minél inkább töltéssemlegessé téve azt.

A következő publikációban a szűrő sugarának illetve dielektromos együttha-tójának kombinált hatását vizsgálták [64], és megállapították, hogy a kisebb sugár is a jobb szelektivitás irányába hat. Mindkét esetben az erősebb kalcium-szelektivitás magyarázata, hogy a szűrőben nagyobb lesz a kationok sűrűsége, ezáltal erősebb a rendelkezésre álló helyért zajló versengés a kalcium és a nátrium között.

Minél erősebb ez a verseny, annál kedvezőbb a helyzet a kalcium számára. Ezzel a két paraméterrel (R és ) tehát széles tartományban lehet hangolni a csatorna sze-lektivitását. Mindkettő az ioncsatorna szerkezetétől, tehát a genom által vezérelt szerkezettől függ. Ez azért fontos, mert hasonló összetételű szelektív szűrővel (4E vagy 4D) ismerünk nagyon szelektív kalciumcsatornákat (L-típusú), illetve gyengén szelektív kalciumcsatornákat (Ryanodine receptor).

Az L-típusú kalciumcsatorna szelektivitására vonatkozó összefoglaló jellegű publikációban [65] számos egyéb kísérlettel hasonlították össze a modellből kapott szimulációs eredményeiket kielégítő eredménnyel.

Egy másik kutatócsoport – nevezetesen Chung és munkatársai – is javasolt egy érdekes modellt a kalciumcsatornára [66 - 70]. Modelljükben a szelektív szűrő negatív strukturális töltéseit a falon kívül (a fehérje belsejében, a kis dielektromos együtthatójú tartományban) helyezték el rögzített pozíciókban. Ezt a merev modellt, amelyből hiányzik a zsúfolt szűrőben versengésre kényszerített kationok koncepció-ja, Brown-dinamikai szimulációkkal vizsgálták nagy Ca²⁺-koncentrációknál (>18 mM). Ezekből az eredményekből öt nagyságrendet extrapoláltak mikromólos Ca²⁺-koncentrációkra, és azt állították, hogy a modell képes a mikromólos kalcium-blokk reprodukálására. Boda és munkatársai közvetlenül GCMC szimulációkat vé-geztek a mikromólos Ca²⁺-koncentráció-tartományban erre a modellre [71], és meg-mutatták, hogy a modell csak milimólos Ca²⁺-szelektivitással rendelkezik.

Gillespie mutációs kísérletekre és elektrofiziológiai mérésekre alapozva kifej-lesztette a Ryanodine receptor egy redukált, de viszonylag részletes modelljét [39;

40]. Ezt a modellt Poisson-Nernst-Planck egyenlettel vizsgálta. Ez azt jelenti, hogy a

Nernst-Planck elektrodiffúziós egyenletet elektrosztatikailag önkonzisztens módon oldja meg, tehát az iteráció során a Poisson egyenlet is mindig érvényes marad. A kémiai potenciál többlet tagját egy általa kifejlesztett sűrűség funkciónál elmélettel (DFT) számolja. Ezzel a DFT/PNP elmélettel reprodukálni tudta a Ryanodine recep-tor áram-feszültség karakterisztikáit több száz különböző elektrolit-összetételre a membrán két oldalán.

A CSC mechanizmus megerősítésére Miedema és munkatársai génmutációs kísérleteket végeztek [72; 73] egy OMPF-porin nevű fehérjével. A CSC mechaniz-mus által inspirálva genetikailag módosították a csatorna szerkezetét, oly módon hogy pozitív vagy töltetlen aminosavakat negatív aminosavakra cseréltek, ezáltal a porint kalcium-szelektívvé tették. A meglehetősen nagy átmérőjű porin falára külön-böző csoportokat ragasztva csökkentették a csatorna átmérőjét, ami szintén a kalci-um-szelektivitás irányába hatott.

Boda és munkatársai nátriumcsatornákra is kiterjesztették vizsgálataikat [74].

A modell sikerére a legjellemzőbb példa, hogy reprodukálta a 4.2 fejezetben ismerte-tett Heinemann kísérletet [47] (4.3.1. ábra). Látható, hogy kalciumot adagolva a rendszerhez 10^-4 M-nál a felére blokkolja az áramot, és ez összhangban van a kísérle-tekkel (4.2.6. ábra).

Ez a kísérlet arra enged következtetni, hogy ezen két ioncsatorna-fajtának ha-sonló módon épül fel a szelektív szűrője, csak különböző aminosavakat tartalmaz. Az is elképzelhető, hogy a két ioncsatornának hasonló elven működik a szelektivitása.

Boda és munkatársainak szimulációi megmutatták, hogy ez a mechanizmus a CSC mechanizmus lehet. Rámutattak továbbá, hogy a Na⁺ versus K⁺ szelektivitás mecha-nizmusa nem az, hogy a csatorna több nátriumot vonz be a szűrőbe, mint káliumot, hanem hogy több káliumot szorít ki onnan, mint nátriumot. Az így keletkező kálium kiüresedési zónák megjelenése kritikus fontosságú. Ezen kiüresedési zónák szerepe később egyenletbe is lett foglalva. Megmutatták, hogy a Nernst-Planck elektrodiffúziós egyenlet egy integrált alakjából kiszámítható a csatorna vezetőké-pessége az egyensúlyi szimulációkból kapott sűrűség profilokból [75], lásd 4.7 feje-zet.

4.3.1. ábra

Boda és munkatársai vizsgálták a szűrőben lévő kationok számát különböző nátriumcsatornák eseté-ben. Látható, hogy a DEEA jelű csatorna erősen Ca²⁺-szelektív, míg a DEKA jelű csatorna erősen

Na⁺-szelektív.

Mindezen szimulációk egyensúlyban folytak nagykanonikus sokaságon, ezért a különböző ionok transzportjára csak áttételesen lehetett következtetéseket levonni az integrált Nernst-Planck egyenletből. Egy frissen megjelent publikációban már közvetlenül szimulálták az ionok áramlását a dinamikus MC módszer segítségével [76], és érdekes következtetéseket vontak le a kalciumcsatorna kalcium-affinitása és a fluxusokkal kifejezett dinamikus szelektivitása között.