Kísérleteink egyik fő motiváló tényezője és ötletadója volt, hogy felfigyeltek arra, hogy a haltenyésztési, halgenetikai szakkönyvek által oly sokat emlegetett genetikai modellben, Kirpichnikov modelljében várt letalitás a magyarországi, hajdúböszörményi bőrpontyok keresztezésekor sorozatosan nem következett be.
Kirpichnikov és kollégái két gén két allélját (S; s; N; n) tették felelőssé a pikkelymintázat alakulásáért (Kirpichnikov 1981, 1999). Az első gén (s) meghibásodása okozza a részleges pikkelyhiányt, a tükrös fenotípust. Ezt a gént azonosították, a fibroblaszt növekedési hormon 1-es receptoraként (fgfr1a) (Rohner és mtsai., 2009).
Habár ennek a génnek az embrionális fejlődés során nélkülözhetetlen szerepe van, a zebradánióban és a pontyban jelenlévő paralógok egy enyhébb fenotípust biztosítanak.
A japán medakában (Oryzias latipes) a génnek nincs paralógja, így a homozigóta mutáns embriók teste csökött marad, csak a fejük fejlődik (Yokoi és mtsai., 2007).
Úgy gondoljuk, hogy a második (N) gén, melynek funkcióvesztése a teljes pikkelyvesztést okozza, az s génnel összehangoltan működhet a downstream targetek expresszálódásának szabályozásában. Így a fő fenotípusok mellett a két gén változatos hatásainak kombinációjából alakulhatnak ki a köztes fenotípusok. Szerintünk a modellben helye van ezeknek a köztes fenotípusoknak is, továbbá hozzásegítenek ennek a komplex rendszernek a megértéséhez is. Ezért osztottuk tovább Kirpichnikov tükrös fenotípusát három altípusra. A rendszert még összetettebbé tették a ponty genom duplikációs eseményei, a ponty ugyanis keresztülment egy extra genom duplikáción, így a tetraploid állapotú ponty géntartalma meglehetősen komplex.
Mi most egy reosztát–jellegű modellt szeretnénk javasolni az öröklődés megértéséhez.
Egy új, lehetséges modell felállítása
Bár az N gént még nem sikerült megtalálni, keresése tovább folytatódik.
Kísérleteink adatait összehasonlítva, két mutáns változat valószínűsíthető: egy gyengébb (európai) és egy erősebb (ázsiai) mutáns N allél.
A fenotípusban fokozatos változást figyeltünk meg a pikkelyezettség csökkenésével párhuzamosan. A magyarországi keresztezéseknél elmaradt drasztikusabb változásokat az európai pontyoknál a feltételezett mutáns N allél
84
gyengébb változata, az Fgf kaszkádrendszerben történt mutáció gyengébb kifejeződéseként értékeljük, míg a távol-keleti szingapúri koi pontyoknál egy erősebb típusú mutáció miatt történhetett az életképtelen utódok megjelenése. Az európai allél pikkelyvesztést okoz, míg az ázsiai allél markánsan kihat a garatfogakra, úszókra is, úgy, hogy az esetlegesen túlélt utódok szinte úszni sem tudnak. Kirpichnikovék valószínűleg az erősebb mutáns N allélt hordozó halakkal dolgoztak.
A hipotézisünket egy új modellel szeretnénk szemléltetni. Ebben a modellben a pikkelymintázat teljessége a pikkelyek keletkezésének helyén lévő Fgf szignál szintjétől függ. Modellünk szerint, bár Kirpichnikovék a két gént két különböző kromoszómára helyezték, a két gén működésében nem teljesen független egymástól, mivel ugyanazon a kaszkád(ok)on keresztül szabályozzák az Fgf szignál szintjét, ezzel a downstream targetek aktivitását. Feltevésünk szerint az új köztes fenotípusok (szabálytalan és hiányos pikkelyes) megjelenését a tükrös és bőr fenotípusokhoz képest az Fgf jelszint növekedése eredményezhette függetlenül attól, hogy valóban az Fgf jelátviteli kaszkád egyik génjében történt új mutációtól van szó, vagy hogy egy másik, upstream kaszkádrendszer csatlakozik be az Fgf kaszkádredszerbe. A köztes fenotípusokhoz hasonló, nagy, nem átfedő pikkelyű pontyokat figyeltek meg triploidizáció során, SssNnn genotípussal, pikkelyes és bőr anyáktól, feltehetőleg az N allél vad típusú n alléljaival szembeni részleges dominanciája miatt (Gomelsky és mtsai., 2012). Ráadásul a triploid bőr pontyok sssNnn genotípussal kevésbé súlyos fenotípusos hatásokat mutattak (csökkent pikkelyborítottság, és farok alatti úszósugár szám) diploid (ssNn) társaikhoz képest (Gomelsky és mtsai., 1992).
A köztes fenotípusok nagyobb pikkelyeinek fejlődési okát nem tudjuk, ennek megismeréséhez további kutatások szükségesek.
Egyik nagy előnyük a „pikkelyvesztett” fenotípusoknak, hogy rámutatnak a halak testének pikkelyesedésre leginkább hajlamos részeire, amelyek: a hát, az oldalvonal és a hasi rész. Ezt normál pikkelyes vad fenotípusokon nem tudtuk megfigyelni. Ezeken a részeken az Fgf receptorok sűrűbben helyezkednek el, az Fgf szignál alacsonyabb szintje is elegendő a pikkelyek megjelenéséhez. Ilyen fenotípusokat más pontyféléknél is megfigyeltek pl.: az aranyhalnál (http://mirrorscalegoldfish.blogspot.com/), amurnál (53. ábra) és egy patagóniai fajnál, a Gymnocharacinus bergi – nél. Ennél a veszélyzetetett fajnál a pikkelyek először kifejlődnek az egész testen, majd később az oldalvonal kivételével felszívódnak –így alakul ki oldalvonalsoros fenotípusuk (Ortubay és Cussac, 2000). A helyzet a többi fenotípusnál bonyolultabb, hiszen vannak olyan
85
egyedek, ahol a hátúszó hiányzik, de a pikkelyvonal alatta megvan. Az ilyen jelenségek két lehetséges magyarázata: a) az úszók kialakulásához magasabb Fgf küszöbszint szükséges, mint a pikkelyzet képződéséhez, vagy b) a mutáció korai hatása erősebb, mint a későbbié.
A következőkben a modellt szemléltető ábrákat szeretnék bemutatni (54. ábra):
54. ábra: A hipotézisünk a mutációk reosztát-jellegű hatását mutatja az Fgf kaszkádból származó jelek szintjére. A különböző testrészek változó jelerősségi szintjei és a különböző allélkombinácók fokozatosan csökkenő jelintenzitása, (és a járulékos módosító gének potenciális hatása) vezethet ezen fenotípusok kialakulásához. Egy képzeletbeli hát-hasi keresztmetszet felső része mutatja a testfelszín D: dorsal=háti L- lateral=oldalsó és V-ventral=hasi részeken a pikkelyképződés tipikus helyeit, míg a zöld vonal a A) pikkelyes, B) szabálytalan és a C) tükrös pontyok kialakulásához szükséges jelerősség küszöbszintjét mutatja.
Végül szeretném bemutatni az N gén megtalálásához nagy segítséget jelentő oldalvonalsoros amurt (55. ábra), melynek kromoszóma száma 2n=48, így a tetraploid pontyhoz képest egyszerűbb genetikai háttérrel rendelkezik.
A ponty pikkelyesedésre leginkább hajlamos részei
Az Fgf szint
szabályozása a bőrben az fgf allélok funkciója
A pikkelyesedésre hajlamos pontok szabályozása a bőrben: fgfr funkciója (ahogy a vonal formájával változik)
86
55. ábra: Sári János és Simonics Géza találtak egy korához képest elmaradt növekedésű, oldalvonalsoros amurt a Hortobágyi Halgazdaság Zrt. egyik tavában, amely reményeink szerint segítségünkre lesz a teljes pikkelyvesztést okozó N gén felkutatásában. (Fotó: Bercsényi M.) (Bercsényi és mtsai., 2011).
Rudzinsky óta az ’S’ gén megtalálásához (Rohner és mtsai., 2009) több mint 80 évet kellett várni. Mi jelenleg ezen génpáros másik tagjának azonosításán dolgozunk, három utat követve.
Elsőként a kutatócsoport az Fgf transzdukciós kaszkád számos kulcsfontosságú tagját azonosította, és azon upstream kaszkádokból származó géneket, melyekről korábban bebizonyosodott, hogy ezen folyamatok szabályozásban szerepet játszanak [ pl. (Gibert és mtsai., 2010; Haworth és mtsai., 2007)]. A bőr és tükrös utódcsoportokból származó cDNS összehasonlító szekvencia analízise lehetővé teheti az N gén azonosítását.
Másodszor számos F1, F2 térképezési családot hoztunk létre európai és ázsiai pontyok keresztezésével, részben vagy teljesen pikkelytelen fenotípusú egyedek részvételével. A genetikai kapcsoltság feltérképezése, amely rutin gyakorlattá vált a pontynál [pl. Cheng és mtsai., 2010; Zhang és mtsai., 2012; Zheng és mtsai., 2011)], fel fogja fedni a kromoszómán a helyet, ahol a kérdéses gén megbújik. A szekvenált csontos hal modellekben, különösen a zebradánió szintenikus régióiban található gének összehasonlító bioinformatikai elemzése lehetővé teheti, a lehetséges jelöltek listájának szűkítését. Ha ez a megközelítés nem azonosítja a mutáns gént, térkép alapú pozicionális klónozás is elvégezhető az azonosításhoz.
Harmadszor, a hagyományos (Christoffels és mtsai., 2006) és a NGS (Újgenerációs Szekvenálás) alapú szekvenálási törekvésekből (Henkel és mtsai., 2012;
Ji és mtsai., 2012) származó, gyorsan gyarapodó szekvencia információk már hoztak előnyöket a teljes hosszúságú cDNS-szekvenciák izolálásához és jellemzéséhez. E tevékenységek egyik rövid távú előnye, a nyilvánosan is hozzáférhető minőségi
87
transzkriptum (Henkel és mtsai., 2012) lehetővé teszi az RNS-szekvencia alapú transzkriptomikai vizsgálat, amely jelentős javulást hoz a jelenleg elterjedt módszerhez, a cDNS microarray-hez képest (Williams és mtsai., 2008).
Reményeink szerint ezen megközelítések együttes alkalmazása hamarosan az ’N’
gén megtalálásához vezet majd, továbbá a ponty bonyolult pikkelymintázat- kialakulásának megértéséhez.
88