Fibroblaszt növekedési faktor transzdukciós kaszkád

Az „s” gén megtalálásával kapcsolatban a fibroblaszt növekedési faktorról (Fibroblast growth factor; FGF), és receptorának egyik paralógjának, az Fgfr1-nek halakban betöltött szerepéről kaptunk új ismereteket.

Az Fgf szignál alapvető fontosságú számos fejlődési folyamatban szerte az állatvilágban (Coulier és mtsai., 1997; Gibert és mtsai., 2010; Goldfarb, 2005). Az emlősöknél és a madaraknál alapvető fontosságúak a végtagok képződéséhez (Mao és mtsai., 2009; Vogel és mtsai., 1996). Az emberekben pedig szerepük van például a csontképződésben, szaglásban és a reprodukcióban (Wilkie 2005).

Kimutatták, hogy a halaknál számos Fgf ligand és receptor vesz részt: i) a pikkelyzet (Kondo és mtsai., 2001; Rohner és mtsai., 2009), ii) a hátúszó elődjének a medián rétegnek (Abe és mtsai., 2007), iii) a páros úszóknak (Prykhozhij és Neumann, 2008), IV) és a zebradániók oldalvonalának (Gallardo és mtsai., 2010; Ma és Raible, 2009; Sarrazin és mtsai., 2010) kialakításában, valamint az úszók regenerálódásában (Poss és mtsai., 2000; Stoick-Cooper és mtsai., 2007).

A fibroblast növekedési faktor receptorok (FGFRs) a receptor-tirozin-kináz-család tagjai, amelyek az FGF-eket megkötik (W. J Park és mtsai., 1995).

Az FGF család szerkezetileg rokon polipeptidekből áll, amelyek kulcsfontosságú szerepet játszanak az embriogenezisben, a növekedésben, a homeosztázis fenntartásában, a sejtek jelátviteli folyamataiban (Burgess és Maciag 1989;

Gospodarowicz 1990; Basilico és Moscatelli 1992).

Az FGF-eket hatásmechanizmusuk alapján parakrin, endokrin, és intrakrin csoportokba sorolhatjuk (Itoh és Ornitz, 2008). A parakrin FGF-ek a biológiai válaszokat közvetítenek kötődve és ezzel aktiválva a sejtfelszíni tirozin kináz FGFR-okat (Sayaka és mtsai., 2011). A fibroblaszt növekedési faktor család az egyik legfontosabb csoportja a fejlődés alatt szerepet játszó parakrin faktoroknak. (A parakrin jelátviteli rendszerek a sejtek közötti kommunikáció olyan formái, ahol a sejtek keltette jelek a szomszédos sejtekben változásokat indukálnak, megváltoztatva ezzel a szomszéd sejtek működését vagy differenciálódását. Ezen parakrin faktorok hatása viszonylag rövid távolságra terjed ki, a közvetlen közelben fejtik ki hatásukat.) (Gilbert 2000).

Feladatuk, hogy meghatározzák mely sejtek váljanak mezodermává, szerepük van a vérerek kialakításában, a végtagok kinövésében és számos más sejttípus növekedésében és differenciálódásában.

45

Az emberi FGF géncsaládnak 22 tagja van. A zebradánió FGF géncsaládot legalább 27 tag alkotja. A jelátviteli rendszer mechanizmusai összetettek és még nem teljesen tisztázottak (Itoh és Konishi, 2007).

A zebradánió FGF család

A zebradánióban szinte minden ember/egér Fgf gén ortológot azonosítottak már, kivéve az Fgf9-et. Az Fgf24-et nem csak a zebradánióban, de az összes vizsgált csontos halban megtalálták; beleértve a tüskés pikót, medakát és gömbhalat, azonban az Fgf24-et nem tudták azonosítani a vizsgált négylábúak mindegyikében. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az Fgf9 és az Fgf24 elvesztek a csontos halak és a négylábúak leszármazottaiban az evolúció során. A zebradániónak további hat FGF génje ismert, beleértve: fgf6b -ét, fgf8b -ét, fgf10b-ét, fgf13b-ét, fgf18b-ét és fgf20b-ét. A zebradánió FGF géncsaládja huszonnyolc tagból áll. A további gének helyének elemzése azt mutatja, hogy azok paralógok (20. ábra) (Itoh és Konishi, 2007).

20. ábra: Az ember/egér/zebradánió Fgf géncslád evolúciós története. Az Fgf13-like az Fgf család ősi génje. Az Fgf13 duplikációjával keletkezett az Fgf4-like gén. (Itoh és Konishi, 2007).

Az emlősök és a csontos halak génjeinek összehasonlítása azt mutatta, hogy a csontos halakban, beleértve a zebradániót is, gyakran az emlősökével egyenértékű két homológ van. Ez arra utal, hogy történt egy újabb genom-duplikáció (R3), röviddel a csontos halak evolúciós elválása után. Ez a megkettőződés egy részleges vagy a teljes genomora kiterjedő duplikáció lehetett, amelyet gyors génvesztés követett, mivel a génduplikációk aránya mindössze a vizsgált zebradánió géneknek csak ~ 20%-ára terjed ki (Nusslein és mtsai., 2002). Genom duplikáció révén jöttek létre a zebradánió Fgf paralógok is.(Sayaka és mtsai., 2011).

46 A receptorok aktiválódásaés ismert mutációi

A Fibroblaszt növekedési faktor receptoraihoz kötődésekor a receptorok dimerizációját okozza, és ez eredményezi a tirozin-kináz fehérjék aktiválódását. Ezek a kinázok foszforilálják egymást, és downstream jelátvitelt kezdeményeznek (21. ábra).

Három összetevője van ennek a szignálnak. A fő szignál magában foglalja a Ras G-protein és a MAP-kináz kaszkád aktiválását. Ezen túlmenően, az aktivált receptor stimulálja a foszfolipáz C-fehérjét, amely hasítja a foszfoinozitol 4,5-biszfoszfát (PIP2)-ot inozitol 1,4,5-triszfoszfát (IP3)-ra és diacil-glicerol (DAG)-ra. Alternatív megoldásként, az aktivált receptorok a sejtmagba transzlokálódnak és endocitózissal foszforilálják a transzkripciós faktorokat (W. J Park és mtsai., 1995).

21. ábra: A szignál transzdukciós kaszkádot az FGF fehérjék receptoraihoz kötődése aktiválja. A fotofoszforilált FGF receptorok legalább két féle szignált generálnak. Egyet a RAS G fehérjéken keresztül, amely új mRNS-ek átíródásához vezet, és egy másikat a Foszfolipáz C –n keresztül, amely a citoplazma ion-koncentrációjának megváltoztatásához vezet (Park és mtsai.,1995. nyomán).

Az FGF kötődése a receptoraihoz proteoglikánok, nevezetesen a heparin vagy Heparán-SO4 segítségével valósul meg (22. ábra, A). A heparin proteoglikánok FGF

47

molekulákat kapcsolnak össze egy hálózatba, amely a receptorokhoz kötődik. Ezúton a receptorok térhálót alkotnak.

22. ábra: A) A heparin- indukált dimerizáció és a FGF receptorok aktivizációja (Spivak és mtsai., 1994 nyomán). / B) Pfeiffer szindróma:súlyos proptózis (szemgolyó előreesése); lóhere koponya; lapos hüvelykujj; a nagylábujjak rendellenes ujjpercei (Elisabeth és mtsai., 2006).

Az FGFR1 mutációk embereknél súlyos következményekkel járnak. Példa erre a Pfeiffer szindróma (FGFR1, FGFR2 mutáció), amely egy autoszómálisan domináns betegség. Tünetei a csontképződési hibák, a kezek és a lábak jellegzetes rendellenességei és lóhere koponya kialakulása (22. ábra, B).

Az emberi Fgfr mutációk különböző változatatit és a fenotípusokat mutatja a 23.

ábra.

23. ábra: Az emberi növekedési faktor receptor mutációk különböző változatai és azok fenotípusai. A fekete négyszög a transzmembrán domént reprezentálja. A hurkok pedig az immunoglobulin-szerű doméneket ábrázolják (diszulfid hidakkal stabilizálva) (Yamaguchi és Rossant, 1995 nyomán).

A B

48

Rohner és munkatársai a pikkelyes Telestes spp. és a pikkely nélküli Phoxinellus alepidotus fajok összehasonlításakor három különböző 1 bázispáros polimorfizmust találtak, amelyek közül az egyik az Fgfr1 működését meghatározó régióban van. Ebben a fehérje régióban a szomszédos aminosavak változásai, az embereknél előforduló, Kallmann szindrómát okozzák (Hardelin 2008).

A 24. ábra az Fgfr1a sematikus szerkezetét és a tükrös zebradánióban megjósolt mutációk helyét is mutatja (Rohner és mtsai., 2009).

24. ábra: Az fgfr1a szerkezetének és a zebradánióban lévő mutációk helyének megjósolt sematikus rajza.

Ig: immunoglobulin; TM: transzmembrán; a kináz 2 doménben t3R705H: missense mutáció; huW671X:

korai stop kodon (Rohner és mtsai., 2009).

A ponty pikkelymintázatának vizsgálata során két egymástól független Fgfr1a1 kináz domént érintő mutációt azonosítottak (25. ábra), amelyeket a tenyésztők a ponty domesztikációja során egymástol függetlenül szelektáltak ki kétszer (Rohner és mtsai., 2009).

25. ábra: A felső sorban a „vad” fenotípusú pikkelyes, míg az alsó sorban a tükrös ponty adatai láthatóak.

A bal oldali ábra mutatja a molekuláris változást a tükörponty fgfr1a deléciós alléljában az exon / intron határán lévő genomi régió elvesztését. / A középső képen: Amplifikált méret polimorfizmusok a pikkelyes és tükörponty genomi régiójából. / A jobb oldalon a tükrös ponty második alléljában történt nukleotid változás látható. (Rohner és mtsai., 2009)

49 2.11.2. Az ’ectodysplasin’ anyagcsereútvonal

Az eda (hivatalos neve: “ectodysplasin A”), a Tumor Nekrózis Faktor receptorok (TNFr) szupercsaládjának tagja. Az ectodysplasin A egy fehérje, amelyet az eda gén kódol. Az ectodysplasin A receptor is egy fehérje, amelyet az edar gén kódol (Wiśniewski és mtsai., 2002).

26. ábra: Az ectodysplasin kaszkád sematikus rajza: A kaszkád eleme a három ismert receptor: Troy, Edar, Xedar és egy ismert ligandum, az Eda. Két különböző splicing formáját írták le az Eda-nak: Eda-a1 és Eda-a2. Az Eda-a1 az Edar-hoz kötődik, míg az Eda-a2 a Xedar ligandja. A Troy ligandja nem ismert.

Az NF-kB (nukleáris faktor kappa könnyű-lánc-enhanszer az aktivált B-sejtek) egy olyan fehérje komplex, amely szabályozza a DNS átírását. IKK: IkappaB kináz; TRAF6: TNF receptorhoz kapcsolt faktor 6 (Rohner, 2010).

Az Eda és Edar fehérjék egy jelátviteli kaszkád részei (26. ábra), amelyek fontos szerepet játszanak az embrionális fejlődés során. Ezek a fehérjék nélkülözhetetlenek a két embrionális sejtréteg, az ektoderma és a mezoderma közti kölcsönhatásokhoz. Az embrionális fejlődés kezdetén ezek a sejtrétegek képezik a test szerveinek és szöveteinek alapját. Az ektoderma- mezoderma kölcsönhatások nélkülözhetetlenek az ektodermából fejlődő sruktúrák pl., a bőr, a haj, a körmök, fogak és a verejtékmirigyek kialakulásához (Mikkola és Thesleff, 2003).

Rohner és munkatársai (2009) a pikkelyzettséget érintő zebradánió mutánsok vizsgálatával bebizonyították, hogy halaknál az Ectodysplasin jelátviteli kaszkád elemei nélkülözhetetlenek a pikkelyek, az úszók és a fogak kialakulásához. Ez a kaszkád a felnőttkori struktúrák fejlődését érinti, lárvakorban a mutáció jelei nem láthatók.

Az edar egy allélja a kaszkád rendszer dózis függőségét mutatta: a pikkelyzet kifejlődése magasabb edar jelátviteli szintet igényelt, mint az úszók kialakulása. Kétféle

50

mutációt találtak: egy idő előtti stop kodont a ligandum (eda)- ban, amely a pikkelyek, fogak és úszók teljes vesztését okozta, valamint 5 allélt, amelyek a receptorban (edar) hordoztak mutációt (Harris és mtsai; 2008). Az embereken ezen gének ortológjainak mutációja felelős a Hypohydrotic Ectodermal Displasia (HED) betegség kialakulásáért, ami a fogak és a szőrzet vesztését okozza az érintettekben (Mikkola 2009).

Az ectodysplasin zebradánió pikkelyzetének kialakításában betöltött szerepének leírása előtt (Harris és mtsai., 2008) csupán két tanulmányban neveztek meg a pikkelyek differenciálódásához és fejlődéséhez szükséges géneket: először egy hiányos pikkelyezettségű medakáról (Oryzias latipes) számoltak be Kondo és munkatársai (2001), ahol is az ectodysplasin receptor (edar) felelős a fenotípus kialakításáért . Ez a gén emlősöknél a szőrzet kialakításában játszik szerepet. Ebben a tanulmányban először olvashattunk a szőr és a pikkelyek fejlődésének ugyanazon genetikai kaszkádrendszer általi kapcsolatáról (Kondo 2001).

A második publikációban (Colosimo 2005) édesvízi, vadon élő tüskés pikó populációkban talált, háromtüskés pikó oldalvonalát borító pikkelyszármazékok számának csökkenésével foglalkoztak. A tüskés pikó teste pikkelyek nélküli, csak az oldalvonal mentén van egy csontlapocskák (ezek pikkelyszármazékok) alkotta sor, amely ékszerűen a faroknyélre terjed. A szerzők QTL analízissel vizsgálták, hogy mely gének okozhatták a csontlapocskák hiányát. Kimutatták, hogy az ectodysplasin lókuszánál történt változás okozta a csökkent fejlődést. Mivel azonban a két változat eda génjének nyílt leolvasási keretei között nem volt különbség, azt állapították meg, hogy nagy valószínűséggel a cisz regulációs változások okoztak különbséget az eda gén expressziójában, és ez vezetett az eltérő fenotípushoz. Ezt alátámasztották transzgenikus tüskés pikóval végzett kísérletekkel, ahol az eda gén túlexpresszálódása elegendő volt extra csontlemezkék megjelenéséhez (Colosimo 2005).

Embereknél is gyakran mutálódik ez a gén, a korábban már említet HED-et (Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) adatbázis azonosító: 224900, 305100) okozva (27. ábra). Főként a fogak és a szőrzet fejlődését érinti: jellemző a gyér haj, szempilla, szemöldök, foghiány, nyeregorr; periorbitális ráncosodás, és hiperpigmentáció; kúpos fogak (OMIM).

51

27. ábra: A HED-el érintett páciensek klinikai megjelenése: a) jellegzetes a nyereg orr, a szem körüli ráncok és hiperpigmentáció, ritka haj, szemöldök és szempilla, b) foghiány (Yutaka Shimomura és mtsai., 2004).

2.11.3. Egyéb, szóba kerülhető kaszkádok

A tbx5 gén a T-box transzkripciós faktor család tagja. Fontos szerepet játszanak a sejtdifferenciációban és a morfogenezisben. A zebradánió szívfunkcióit érintő mutációk feltérképezésekor Deborah és munkatársai (2002) azonosítottak egy recessziven letális

„heartstrings” mutánst, amelynek a mellúszói hiányoztak és szívműködési zavarokat mutatott.

Wnt jelátviteli kaszkád: A Wnt elnevezés a Wingless (szárny nélküli) Drosophila melanogaster génjéből származik (Sharma és Chopra, 1976).

A zebradánió wnt5b génjének mutációja a „Pipetail” fenotípust okozza. A farok kialakulásában történik zavar és a fej vázának alakulásában (Rauch és mtsai., 1997;

Kilian és mtsai., 2003). A Wnt jelátviteli (lef1) kaszkádrendszerben történt mutációk a zebradánióknál hatással vannak a fogak, a kopoltyúfésűk számára (McGraw és mtsai., 2011).

A retinsav (RA) egy rendkívül teratogén A-vitamin-származék, nem-peptid típusú, kis lipofil molekula, amely hatással van a hox gének expresszálódására. A gerincesek fejlődéséhez fontos a retinsav közvetítette gén aktiváció. A retinsav a végtagok alakításában is részt vesz (Gilbert, 2003). A zebradánió garatfogazatának fejlődéséhez szükséges a retinsav szignál. A retinsav szerepet játszik a garatfogszám befolyásolásában (Seritrakul és mtsai., 2012), és a melluszony fejlődésében is (Grandel és mtsai., 2002).

Az irodalom az úszók regenerálódási folyamatával kapcsolatban egy szekvenciális jelátviteli kaszkádot említ a retinsavtól kezdve a Wntn és a TBX5en át az Fgf -kaszkádig (Mercader és mtsai., 2006).

52

3. Anyag és módszer

3.1. Az anyapontyok kiválasztása, keresztezésük

3.1.1. Magyarországi keresztezések

A 2008-as pontyszaporítást 2008. május 9- én Százhalombattán, az akkori Temperáltvizű Halszaporító Gazdaság (TEHAG KFT.) keltetőjében, a ponty természetes ívási idejében, 21 °C-os vízben, standard üzemi technológia (28. ábra) szerint végeztük. Az anyahalakat szegfűszegolajjal altattuk, majd hipofízissel kezeltük őket Horvath és munkatársai (1984) szerint. Az anyahalak ivarnyílását bevarrtuk, hogy az ikrát ne szórják el. A fejés idejének megállapításához jelző tejeseket alkalmaztunk.

A fejéshez a halak ivarnyílását szárazra töröltük, az ikrások esetében szabaddá tettük. A kiválasztott egyedek ivartermékeit külön-külön száraz, műanyag tálakba fejtük, ügyelve, hogy víz ne kerüljön rá. A tejet és az ikrát csoportonként, szárazon kevertük össze, majd az ikra ragadósságának megszüntetéséhez és duzzasztáshoz Woynárovich-féle termékenyítő oldatot (10 liter vízbe 40 g konyhasó és 30 g karbamid) öntöttünk hozzá (Woynarovich 1962). Csersavas kezelés után az ikrát csoportonként Zuger-üvegekbe helyeztük el. A 2008-as keresztezéshez 2 oldalvonalsoros és egy tükrös ikrást és két oldalvonalsoros, valamint egy-egy bőr és tükrös tejest használtunk (3. táblázat).

28. ábra Képek a szaporításról: hipofizálás, ivarnyílás bevarrása, ikra fejése, Zuger-üvegek (Fotó: Szücs Réka)

A 2009-es pontyszaporítást, a vizsgálat alapjául szolgáló ivadékok előállítását a ponty természetes ívási időszakát megelőzően, 2009. február 5-én végeztük Szarvason, a Haltenyésztési Kutató Intézet (HAKI) keltetőjében (3. táblázat). A 2009-es keresztezésekhez 3 ikrást (tükrös, oldalvonalsoros, bőr) és 3 tejest (tükrös, oldalvonalsoros, bőr) használtunk. A mesterséges termékenyítést a standard üzemi technológia szerint végeztük (Horvath és mtsai.,1984), de az eddigiektől eltérően, hogy

53

a termékenyülést vizsgálhassuk, az ikrák ragadósságát megtartva és kihasználva, a fotódokumentációhoz azokat csoportonként 4-4 keretes hálóra ragasztottuk, és a keretek közül 1-1-et Keszthelyre szállítottunk. Egy kereten kb. 2000 ikra volt. Az ikrák jól

3. táblázat: A Magyarországon végzett keresztezések Sc=scaled=pikkelyes;

Li=linear=oldalvonalsoros; Mi=mirror=tükrös; Nu=nude=bőr (A továbbiakban ezeket a jelöléseket használjuk.)

A 2010-es pontyszaporítást (3. táblázat) június elején a ponty természetes ívási időszakában végeztük el Szarvason, a HAKI keltetőjében, 2008-as szaporítással azonos standard üzemi technológia szerint.

Arra voltunk kíváncsiak, hogy az S gén valóban úgy viselkedik-e, ahogy azt a szakirodalomban írták, tehát hogy a teljes pikkelyezettségű ponty domináns-e a tükrös típus felett. A keresztezésekhez 5 anyahalat használtunk (pikkelyes, tükrös és bőr ikrásokat; pikkelyes és oldalvonalsoros tejeseket). Termékenyülési, kelési stb. adatokat nem gyűjtöttünk.

54

Anyahalak (2008, 2009) Li X Li 7 (2008)

Li X Li 8 (2008)

Li X Nu 10 (2008)

Li X Mi 9 (2008)

Li X Nu 22 (2009)

55

Nu X Li 27 (2009)

Li X Mi 23 (2009)

Mi X Nu 21 (2009)

Nu X Nu 26 (2009)

Li X Li 24 (2009)

56

Nu X Mi (2009)

29. ábra: Az anyahalak (Fotó: Dr. Lehoczky István; Szücs Réka)

Akísérlethez használt anyahalak (29. ábra) közül a pikkelyesek a HAKI (Szarvas;

Magyarország) élő génbankjából – Amuri vad típusú pontyok és Tatai pontyok voltak (Dr. Bercsényi Miklós személyes közlés). A tükrös pontyok szintén a HAKI-ból: a No2 vonal. Az oldalvonalsoros pontyok a Tiszaker halgazdaságból (Kőröstarcsa, Magyarország); a bőrpontyok pedig a Béke halgazdaságból (Hajdúböszörmény, Magyarország) származtak (Dr. Bercsényi Miklós személyes közlés).

Az anyahalakat és a jelölni kívánt F1 nemzedék tagjait úszócsonkolással, később PIT (passive integrated transponder) tag jelöléssel láttuk el, a gyártó ajánlásai szerint (30. ábra).

30. ábra: Jelölés PIT taggal (Fotó: Ardó László)

3.1.2. Szingapúri keresztezések:

A Szingapúri csoporttal (Orbán László, Laura Casas, Shubha Vij, Natascha May Thevasagayam, Chin Heng Goh, Purushothaman Kathiresan) együttműködve összesen több, mint 30 keresztezést valósítottunk meg.

57

A szingapúri keresztezésekhez egy európai bőrpontyot szállítottunk Magyarországról Szingapúrba, amelynek spermáját több keresztezéshez használták. A többi szaporításhoz használt anyahal a négy fő fenotípusú koi-pontyok közül került ki, amelyeket a szingapúri Qian Hu Fish Farm bocsátott rendelkezésükre. A szaporítást itt is standard üzemi technológia szerint, hipofizálással (Horvath és mtsai., 1984) végezték, de az ikrák McDonald üvegekbe kerültek, ragadósságukat a Woynarovich-féle oldatokkal (Woynarovich 1962) szüntették meg. Az ikrákból véletlenszerű mintát vettek, a jó/nem termékenyült ikrák aranyát sztereomikroszkóp segítségével számolták.

2012 – a szingapúri F1 nemzedék visszakeresztezése

Szingapúrban a Themasek Lifescience Laboratories, Reproductive Genomic csoportjának halas laborjábantíz különböző keresztezést hajtottak végre a már korábban leírt standard üzemi technológia szerint (hipofizálás, Woynarovich oldat). Az anyahalakat/ keresztezéseket a 4. táblázat mutatja. A tíz keresztezésből négy esetben F1-es hibridet (európai x koi utódja) kereszteztek vissza a bőrponty „nagypapára”.

Keresztezés Tejes Eredete Ikrás Eredete

1. NuMi32BC Nude(gp) Eur Mirror F1hyb

2. MiIr33 Mirror F1hyb Irregular F1hyb

3. NuIr34BC Nude(gp) Eur Irregular F1hyb

4. NuNu35 Nude(gp) Eur Nude Koi

5. MiNu36 Mirror F1hyb Nude Koi

6. MiIr37 Mirror F1hyb Irregular F1hyb

7. NuNu38BC Nude(gp) Eur Nude F1hyb

8. IrNu39 Irregular F1hyb Nude F1hyb

9. NuIr/Li40BC Nude(gp) Eur Irr/Lin F1hyb 10. NuNu/Mi41 Nude(gp) Eur Nude/Mirror Koi

4. táblázat: A pikkelymintázat kialakulását szabályozó genetikai folyamatok mélyebb megértése céljából Szingaúpúrban elvégzett keresztezések listája. Nu/nude - bőrponty; Mi/mirror - tükrös; Ir/Irregular:

rendszertelen pikkelyzetű; BC – visszakeresztezés; gp – tejes nagyszülő (európai bőrponty); hyb – hibrid;

N/A – nincs jelölve .

Ebből 2012-ben Magyarországon is nevelt csoport:

Németh Sándor az NuMi32BC keresztezésből Magyarországra, a keszthelyi hallaborba szállított 4-500 egyedet. Ezek 330 literes akváriumokban nevelkedtek tovább.

58

3.2. Az ikra felragasztása, termékenyülés számolása:

A 2009-es magyarországi szaporítás során az ikra ragadósságát megtartva, azokat egy keretre erősített tüllhálóra ragasztottuk. A termékenyülés pontos megállapításához, a hálóra ragasztott ikrákról szemfoltos stádiumban fotódokumentáció készült (pl. 31.

ábra). A digitális képeken ezután pontosan számolhattuk a termékenyült, ép / sérült ikrákat, majd pedig a kelési százalékot. Ezek a képek aztán az esetleges letalitás mértékénekmegállapításában is döntő bizonyítékként szolgálhatnak.

A keretre erősített halókat az ikrákkal csoportonként külön, egyenként 20 l-es akváriumokba helyeztük (32. ábra). Kelés után így a kelési százalékot/letalitást is pontosabban vizsgálhattuk.

31. ábra: A letalitás hiányának vizsgálatához a pontyok ikráinak felragasztása a Mi xNu, Nu xNu keresztezéseknél. Fotó: Szücs Réka

32. ábra: A hálóra ragasztott ikrák a 20l-es akváriumokban 2 ismétlésben (2009). Fotó: Szücs Réka

59

3.3. A kísérleti halak nevelése:

A tüllhálón lévő megtermékenyített ikrákat (2007-ben az ivadékokat) kevés vízzel töltött, oxigénnel felfújt zsákokban a Pannon Egyetem, Georgikon Kar keszthelyi hallaborjába szállítottuk, ahol az ikrák/ ivadékok a különböző családok összekeveredésének elkerülése végett külön-külön kísérleti akváriumokban nevelkedtek tovább. Először csoportonként egy-egy 20 l- es akváriumban, két ismétlésben. A lárvák indító tápláléknak sórákot (Artemia salina) kaptak, majd fokozatosan keverten Perla Larva majd csak Perla Larva 5.0, 4.0, 3.0 tápokat. Ügyeltünk arra, hogy a sórákból egyszerre csak annyit adjunk egy-egy akváriumba, amennyit az ivadékok rövid időn belül elfogyasztanak. Ezzel, és állandó takarítással tudtuk elkerülni, hogy a kis akváriumok vize a megmaradó, elhalt sórákoktól /petehéjuktól gyorsan „megromoljon”.

Az artémia homogén adagolásához egy 60 ml-es fecskendőt használtunk.

A véletlenszerűen kiválasztott, majd leszámolt halak később átkerültek recirkulációs rendszerben működő 60 l-es húsosládákba majd 330 l-es akváriumokba, létszámukat szisztematikusan csökkentve, 200 majd 100/-as csoportokban a gyorsabb növekedés, és a megfelelő egyedsűrűség tükrében. Skretting classic tápot (1P-3P;

Skretting 1P Classic, 47% fehérje, 14% zsír; Skretting 2P Classic, 45% fehérje, 16%

zsír; Skretting 3P Classic 43% fehérje, 18% zsír) kaptak ad libitum (33. ábra), majd a pikkelyzet kifejlődése, a kísérletek elvégzése és a fényképezés után a megmaradt kísérleti halak nagy körkádakból (300 l-esek) álló recirkulációs rendszerbe vagy a labor fóliatavaiba kerültek.

33. ábra: A kísérleti halak nevelése (Fotó: Havasi Máté)

Noha a kísérleti akváriumok tisztítására, és a betegségek megelőzésére nagy figyelmet fordítottunk, egy 2009-ben előfordult baktériumos fertőzés veszélybe sodorta a kísérleti állományt.

60

A halakat 3 hónapig, a világosan és szabad szemmel is jól látható pikkelymintázat eléréséig neveltük, bár létezik egy festési eljárás (Alizarin red-del, Williams 1946), amivel már 3-4 hónapos korban láthatóvá válnak a pikkelyek.

A későbbi vizsgálatokra, keresztezésekre szánt egyedeket PIT-tag jelölés után tavakban neveltük tovább.

A szingapúri pontyokat a keléstől számított harmadik naptól artémiával, majd mikropellet táppal (Rescue, Japán) etették. A „családokat” 9 l-es akváriumokba; 50-60 egyed/l sűrűséggel telepítették, melyekből később a gyengén úszó egyedeket kisebb akváriumokba <20/l egyedsűrűséggel áthelyezték. Később recirkulációs rendszerben, 200 l-es akváriumokban, akváriumonként 200 egyedet helyeztek el. Ahogy nőttek, a számukat véletlenszerűen kiválasztott egyedek eltávolításával szisztematikusan csökkentették, úgy hogy a 10kg/m³ sűrűséget tartsák. A szingapúri pontyokról is

A szingapúri pontyokat a keléstől számított harmadik naptól artémiával, majd mikropellet táppal (Rescue, Japán) etették. A „családokat” 9 l-es akváriumokba; 50-60 egyed/l sűrűséggel telepítették, melyekből később a gyengén úszó egyedeket kisebb akváriumokba <20/l egyedsűrűséggel áthelyezték. Később recirkulációs rendszerben, 200 l-es akváriumokban, akváriumonként 200 egyedet helyeztek el. Ahogy nőttek, a számukat véletlenszerűen kiválasztott egyedek eltávolításával szisztematikusan csökkentették, úgy hogy a 10kg/m³ sűrűséget tartsák. A szingapúri pontyokról is

In document A ponty (Cyprinus carpio L.) pikkelymintázat öröklődési modelljének revíziója (Pldal 44-0)