Imiquimod kiváltotta psoriasis egér modell

4.8.1. Psoriasiform bőrgyulladás kiváltása imiquimod segítségével

A psoriasiform dermatitist Aldara krémmel (5% imiquimod, Meda Pharma) váltottuk ki, kontrollként vazelint alkalmaztunk. Az első kísérlet-sorozatban az egerek jobb fülét Aldarával kezeltük, míg a bal fület kontroll krémmel, az irodalomban leírtak szerint.(134) Mivel a gyulladásos tünetek főként a fültőnél jelentkeztek, és az általunk vizsgálni kívánt gyulladásos paraméterek ezen a területen nem voltak megfelelően mérhetők, így a második kísérleti sorozatban a hátbőrön végeztük a kezelést, szintén az irodalomban ismertetett módszerek szerint.(135, 136) Ezekben a kísérleti elrendezésekben az imiquimodot igen nagy dózisban, az egerek csaknem teljes hátbőrén alkalmazták a gyulladásos reakció kiváltására.

Tapasztalataink szerint ezek a mennyiségek alkalmasak voltak ugyan a psoriasiform bőrgyulladás tüneteinek kiváltására, azonban jelentős szisztémás hatást is kiváltottak, melyet a kezelés során minden állatnál fellépő 20-25%-os testsúly csökkenés, és egyes állatok elhullása is jelzett. Ezek az általános hatások bizonyos mérési paramétereket (pl. bőr vastagság) közvetlenül, másokat (pl. vérátáramlás) közvetve befolyásolnak, így a mérési eredményekre jelentős hatást gyakorolhatnak. Továbbá, mivel a kezelt felszín mérete miatt egy állaton vagy csak aktív vagy csak kontroll krémet lehet alkalmazni, az állatok közötti eltérések is módosíthatják a kapott eredményeket.

Kísérleteinkhez ezért egy új elrendezést dolgoztunk ki, melyben a psoriasiform gyulladást kisebb mennyiségű imiquimod krémmel is ki lehet váltani, illetve amely lehetővé teszi az Aldara és a kontroll krém egyidejű alkalmazását egy egér hátbőrén. A psoriasiform dermatitis kiváltására az epikután allergia tesztekben alkalmazott finn kamrákban (8 mm FinnChambers on Scanpor, SmartPractice, USA) vittük fel a krémeket az egerek leborotvált hátbőrére ketamine (100 mg/kg i.p., Richter, Magyarország) és xylazine (5 mg/kg i.p., Lavet, Magyarország) altatásban. A kezelést a 4 napos kísérlet minden napján ugyanazon a területen elvégeztük. Így kisebb dózissal (20 mg Aldara vagy 20 mg vazelin), kisebb hátbőr területet kezelve tudtuk kiváltani psoriasiform bőrgyulladást, ami lényegesen enyhébb általános tüneteket eredményezett. A kísérlet végén az altatott állatokat cervikális diszlokációval leöltük.

A levett hátbőr szöveteket paraformaldehidben fixáltuk a szövettani vizsgálatokhoz vagy ^- 80˚C-on tároltuk további elemzésekhez.

4.8.2. Hátbőr duzzadás (ödéma/infiltráció) mértékének meghatározása

A hátbőr vastagságát mikrométerrel (Moore and Wright, Sheffield, England) mértük 0,1 mm pontossággal a kezelés előtt valamint a kezelést követően a megadott időpontokban (1. nap (az első kezelés után 24 órával), 2. nap, 3. nap, 4. nap) a két kezelt területen. Az adatokat a hátbőr vastagság sos változásában adtuk meg a kontroll értékekhez viszonyítva.

4.8.3. A bőrszövet perfúziójának mérése

A hátbőr vérátáramlásának nyomon követését valós idejű lézer Dopplerrel, úgynevezett Laser Speckle Contrast Analysis (LASCA) (Perimed, Svédország) módszerrel határoztuk meg az Aldara kezelést megelőzően, illetve a kezelések során minden nap. A lemért területeket (ROI) a kezelési területeknek (azaz a Finn kamráknak) megfelelően jelöltük ki. A mérés minden esetben két percig tartott, másodpercenként egy kép került rögzítésre, a kijelölt területek átlagos perfúziós értékét a PimSoft szoftver (Perimed, Svédország) segítségével számítottuk ki. Az adatokat a kontroll értékekhez (a kísérlet megkezdése előtti átlagos perfúzió) viszonyítva százalékos változásban adtuk meg.

4.8.4. Lépmegnagyobbodás vizsgálata

A kezelés során kialakuló szisztémás hatások vizsgálatának céljából az első kezelést követő 6 óra, 2 nap, és 4 nap múlva az állatok lépszövetét eltávolítottuk, tömegét lemértük. A kapott értékeket az állat súlyához viszonyítottuk, és kezelést nem kapott, azonos korú állatok relatív léptömegéhez viszonyítva adtuk meg.

4.8.5. Szöveti citokin mRNS expressziós vizsgálatok

Génexpressziós vizsgálatainkhoz az első kezelést követő 6., 48. és 96. órában kezeletlen, vazelinnel kezelt és imiquimoddal kezelt hátbőr szövetmintákat vettünk (n=4), és feldolgozásig azokat -80°C-on RNAlater-ben (Sigma-Aldrich) tároltuk. A mintákból az RNS kivonást Direct-zol RNA MiniPrep Kit-el (Zymo Research) végeztük, a gyártó által megadott protokoll szerint.

Az RNS mintákat 50 percen keresztül DNáz I (DNaseI set, Zymo Research) kezelésnek vetettük alá (10 μl RNS oldat; 2 μl 10-szeres DNáz I puffer; 7 μl víz és 1 µl DNáz I), majd a DNáz I enzimet 10 percen keresztül 65°C-os melegítéssel inaktiváltuk. A DNS mentes RNS oldatok koncentrációját és szennyezettségét NanoDrop 1000 UV/VIS spektrofotométer segítségével állapítottuk meg. 1 μg teljes RNS reverz transzkripcióját végeztük el Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) segítségével, oligo dT-vel, 20 μl térfogatban, a gyártó utasításainak megfelelően. A reverz transzkripció 30 percen keresztül folyt 55°C-on, majd az enzimet 5 percig 85°C-ra való hevítéssel inaktiváltuk. A cDNS oldatokat 0,1-szeres koncentrációra higítottuk.

A kvantitatív valós idejű PCR vizsgálatokat Agilent MX3000P QPCR System segítségével végeztük (Agilent Technologies). A relatív génexpresszió meghatározásához a 2^-ΔΔCt módszert alkalmaztuk. Referencia mintaként a kezeletlen szövetmintákból származó cDNS mintákat

használtuk. Az mRNS expressziós vizsgálatokoz az alábbi assay számú primereket alkalmaztuk: IL-1β - Mm00434228_m1, TNFα - Mm00443258_m1, IL-17 - Mm00439619_m1, IL-22 - Mm00444241_m1 és IL-23 - Mm00518984-m1 (Life Technologies). Belső kontrollként a hipoxantin foszforibozil-transzferáz-1 (Hprt1) gént választottuk (Mm01545399_m1). Az amplifikáció 10 μl térfogatban történt, amelybe összemértünk 5 μl Luminaris Color Probe Low ROX qPCR Master Mix-et (Thermo Scientific), 0,5 μl 10 pmol/μl koncentrációjú primert, 2,5 μl vizet és 2 μl-t a higított cDNS mintákból, a következő PCR programmal: 10 min elődenaturáció 95°C-on, amelyet 15 s denaturáció követett 95°C-on, 30 s primer kötés 60°C-on, és 30 s elongáció 72°C-on, 45 cikluson keresztül. A mérések során 2 technikai replikátumot alkalmaztunk mintánként.

4.8.6. Szöveti citokin fehérjék meghatározása

A fagyasztott hátbőr minták súlyát felolvasztás után lemértük, és 1 ml PBS/PMSF oldatban 4°C-on homogenizáltuk. A mintákat 4000 g-n 15 percig centrifugáltuk, a felülúszókat visszagyűjtöttük. Milliplex Map Kit Mouse Th17 Magnetic Bead Panel használatával meghatároztuk a minták IL-1β, IL-17, IL-22, IL-23 és TNFα koncentrációját. A mérést 96-lyukú lemezen hajtottuk végre a gyártó utasításai szerint, azaz 25-25 μl mintát (higítatlanul), standardot és két gyári kontrollt mértünk fel a lemezre duplikátumban, majd hozzáadtuk az öt különböző citokinre specifikus antitestekkel bevont gyöngypopuláció keveréket. Egy éjszakás inkubálást követően mostuk a mintákat, hozzáadtuk a biotinilált detektáló antitesteket, és újabb mosás után a sztreptavidin-fikoeritrin oldatot. A mérést 150 μl köpenyfolyadékban, mágneses upgrade-del ellátott Luminex 100 készüléken végeztük, mely a medián fluoreszcens intenzitás értékeket mérte xPonent szoftver segítségével. Az adatok kiértékelését MasterPlex 2010 szoftverrel végeztük, 5 pontos görbeillesztéssel határoztuk meg a standard koncentrációkat.

Az eredményeket pg/1 g nedves szövet értékben adtuk meg.

4.8.7. Szövettani vizsgálatok

A kimetszett bőrszöveteket 4%-os paraformaldehidben fixáltuk. A paraffinba ágyazott mintákból 4-6 μm-es metszeteket készítettünk és hematoxilin-eozinnal festettük a gyulladás általános szövettani elváltozásainak megállapítására. A TRPA1 vad típusú és génhiányos minták szemikvantitatív összehasonlítását patológus végezte, aki nem ismerte a kísérleti elrendezést. A pontozás szempontjait a pszoriázisra jellemző tünetek alapján a következő módon állítottuk össze: 1.) az epidermisz réteg átmérője, melyet AnalySIS szoftverrel határoztunk meg (pontozás: 1: -25 μm, 2: 26-50 μm, 3: 51-75 μm, 4: 76-100 μm). 2.) A stratum granulosum réteg sejtsorainak száma (pontozás: 1: 1-2, 2: 3-4, 3: 5-6, 4: 7-8). 3.) A dilatált kapillárisok száma az epidermisz alatti rétegben a teljes metszeten. 4.) A Munro-féle mikroabszcesszusok száma a metszetben (pontozás: 1: 1-5, 2: 6-10, 3: 11-15, 4: 16-20). Az

összetett hisztopatológiai pontszámot a fenti értékek összeadásával határoztuk meg az egyes csoportokban.