A RING-finger domént tartalmazó ubiquitin ligázok családjának tagjai állhatnak egyetlen polipeptid láncból, működhetnek dimerként vagy felépülhetnek több alegységből. Nézzük meg közelebbről a névadó RING-finger domén szerkezetét.
RING-finger domén
• ~60 aminosav hosszú szerkezeti egység
• 2 vagy 3 cinkion stabilizálja
Az emlős genom több mint 600 lehetséges RING-finger E3-as enzimet kódol. A legtöbb RING-finger domén két cinkiont tartalmaz (sárga), melyeket 4 cisztein vagy 3 cisztein és 1 hisztidin oldallánc (piros) stabilizálnak. A d o m é n á l t a l á n o s k o n s z e n z u s a m i n o s a v s z e k v e n c i á j a a k ö v e t k e z ő : C-X2-C-X9–39-C-X1–3-H-X2–3-C-X2-C-X4–48-C-X2-C, de más variáció is létezik (2.20. ábra).
2.20. ábra A RING-finger domén alapszerkezete(C3HC4-típus)
A két cinkion és az őket tartó aminosavak egy átkaroló szerkezetet formáznak. A RING-finger doménnek két változata van, a C3HC4-típus és a C3H2C3-típus, melyek nagyon hasonlóak, csak a cisztein/hisztidin mintázatukban különböznek. Az utóbbi típust szokták RING-H2-fingernek is hívni. AzU-boxelnvezésű domén hasonló szerkezet, de nincs benne cinkion (Nalepa és mtsai., 2006).
Egy alegységből felépülő RING-finger domént tartalmazó ligázok
A RING-finger család egyes tagjai egyetlen polipeptidből állnak. Ilyen molekula az Mdm2 illetve egyes IAP fehérjék. Ezek a fehérjék a RING-finger domén részükkel közvetlenül kötok a megfelelő E2-es enzimet és egy másik részükkel pedig a szubsztrát fehérjét (2.21. ábra).
2.21. ábra Egy alegységből felépülő RING-finger típusú ubiquitin ligáz (E3).A piros ellipszis a RING-finger domént jelöli.
Gyakori azonban, hogy ezek a monomer ubiquitin ligázok kettesével, a RING-finger doménjükkel vagy az akörüli régióval összekapcsolódnak, homodimereket hoznak létre. Ilyen például a cIAP (cellular inhibitor of apoptosis, másnéven BIRC2), a SIAH (seven in absentia homologue 1), és a TRAF2 (TNF receptor associated factor 2).
Az ubiquitin-proteaszóma rendszer
Képződhetnek heterodimerek is, erre jó példa az Mdm2 (murine double minute 2, emberben Hdm2) és az MdmX (másnéven Mdm4, illetve emberben HdmX vagy Hdm4) összekapcsolódása, vagy a BRCA1 (breast cancer 1) és BARD1 (BRCA1-associated RING domain 1) együttese. Heterodimerek esetén az egyik RING-domén fehérjének (MdmX, BARD1) gyakran hiányzik a ligáz aktivitása és csak stabilizálja az aktív E2-kötő RING-domént.
SCF komplexum
A legismertebb több alegységes RING-finger domén ubiquitin ligáz enzimek az SCF komplexum típusba tartoznak.
Az SCF rövidítés a legfontosabb alegységek kezdőbetűiből áll össze: Skp1, cullin, F-box (2.22. ábra).
2.22. ábra Az SCF komplexum típusútöbb RING-finger domén ubiquitin ligáz enzim alegységei
Az SCF komplexum a cullint tartalmazó ubiquitin ligázok alaptípusa. A ligáz a szubsztrátfehérjét az egyik alegységének fehérje-kötő doménjével, a 45 aminosavból állóF-box-szal köti meg. Legalább három osztálya van az F-box fehérjéknek, aszerint hogy milyen a szubsztrátkötő részük:Fbw(WD40 - egy rövid kb. 40 aminosavból álló szakasz, gyakran a Trp-Asp (W-D) dipeptidre végződik),Fbl(LRR - leucine-rich repeat),Fbx. Az F-box protein azSkp1(S-phase kinase associated protein) fehérjéhez kapcsolódik, ami adapterként vagy zsanérként a cullinhoz köti. A cullin (cull (ang.): összeszed) állványfehérje a komplexum vázszerkezeteként szolgál és másik végén a RING-finger fehérjét (Roc1/Rbx1)tartja, az pedig egy specifikus E2 enzimhez kapcsolódik (2.22. ábra).
Láthatjuk, hogy egy SCF komplexum specificitását elsősorban a szubsztrát felismerő és megkötő F-box fehérje adja. Ezért egy adott enzim megnevezésekor az SCF rövidítés mellé felső indexként az F-box fehérje nevét írják.
Például, ha az F-box az Fbl1 osztályba tartozóSkp2, akkor SCFSkp2lesz az enzim jele (Petroski és Deshaies, 2005) (2.23. ábra).
2.23. ábra Az SCFSKP2térszerkezete
Egy másik példában az F-box fehérje az Fbw1 osztályba tartozó, 7-szeres WD40 szakaszt tartalmazóβ-Trcp1 (β-Transducin repeat containing protein), a komplexum elnevezése: SCFβTrCP(2.24. ábra).
2.24. ábra Az SCFβTrCPE3 enzim térszerkezete egy lebontandó peptiddel
A szubsztrát fehérje ubiquitinilálását gyakran a szubsztrát fehérje poszttranszlációs módosítása, így hiperfoszforiláció vagy hidroxiláció előzi meg. A különös foszforiláltsági mintázat az egyik jel az E3-as enzim számára a fehérje ubiquitinilálására. Ez játszódik le az SCFβTrCPE3 ligáz két természetes szubsztrátja, az IκB és a β-catenin esetén is.
RING E3 enzim közvetített katalízis mechanizmusa
Az SCFβTrCPE3-as enzim ubiquitinilálási sebessége jelentősen függ az ubiquitinilálandó lizin és az enzim által a szubsztráton felismert ún. destrukciós motívum közötti távolságtól. Ennek vizsgálatára in vitro kísérletben vad típusú és módosított β-catenin és IκBα peptideket használtak (2.25. ábra).
2.25. ábra Az SCFβTrCPE3-as enzim aktivitásának méréséhez használt vad típusú és módosított β-catenin és IκBα peptidek.Az ábrán a destrukciós motívum sárgával jelölt, az ubiquitint fogadó lizinek rózsaszínnel a vad típusú peptidhez képest beillesztett aminosavak a wt+4 és wt+8 mutáns β-catenin peptidek esetén zöldek.
Mint az ábrán látható a két természetes szubsztrátban eltérő a távolság a lizin és a destrukciós motívum között, az IκBα-ban pontosan négy aminosavval rövidebb, mint a β-cateninben. A kísérletben létrehozott módosított β-catenin peptidekben a vadtípusnál 8 illetve 4 aminosavval rövidebb valamint 8 illetve 4 aminosavval hosszabb volt ez a távolság (Wu és mtsai., 2003).
Bár az SCFβTrCPE3-as enzim felismeri mindkét természetes szubsztrátját, a kísérlet kimutatta, hogy az IκBα-t nagyobb aktivitással ubiquitinilálja, mert itt éppen megfelelő az enzim számára a fogadó lizin és a felismert destrukciós motívum közötti távolság. Ha a β-cateninben mesterségesen lerövidítették ezt a távolságot, jobb ubiquitinilálási sebességet kaptak a vadtípushoz képest. Minden más változtatás csak gyengébb aktivitást eredményezett (2.26. ábra).
Az ubiquitin-proteaszóma rendszer
2.26. ábra Az SCFβTrCPubiquitinilálási sebessége függ a szubsztrátpeptid lizinje és a destrukciós motívuma közötti távolságtól.A grafikon az ubiquitinilált peptid / összes ubiquitin arány időbeli változását mutatja. Négy párhuzamos kísérlet átlaga illetve standard deviációja szerepel az ábrán.
VBC komplexum (VHL-ElonginB-ElonginC)
• von Hippel-Lindau tumor szupresszor protein
• VHL disease – sporadikus vese karcinóma
• a Hif1α-t és Hif2α-t (hypoxia indukálható transzkripciós faktor) bontja, mely a VEGF-t (vascular endothelial growth factor) szabályozza
A VBC (VHL-elongin B-elongin C) komplexumot a VHL (von Hippel-Lindau) tumor-szuppresszor fehérjével együtt fedezték fel. Az E3-as enzim szubsztrátja, a Hif1α transzkripciós faktor a SOCS box-ot (suppressor of cytokine signalling) tartalmazó VHL fehérjéhez kötődik. A SOCS box az Skp1-hez hasonló elongin C-hez és az ubiquitin homológ elongin B-hez. A komplexum tagja még a Cul2 cullin és a Roc1/Rbx1 RING-finger protein (2.27. ábra).
2.27. ábra A VBC komplexum vázlata
Az angiogenezis (érképződés) a tumor növekedés és előretörés alapja. Ennek kulcsszabályozója a hipoxia indukálható faktor (HIF) transzkripciós faktor család, melyek a bioenergetikában, sejt növekedésben és érképződésben érintett gének átíródását indukálják. Hipoxiás körülmények között a HIF fehérjék közül a Hif1α és Hif1β aktív és heterodimert képezve a hipoxia válasz génekhez (hypoxia response elements – HREs) kötődnek a célgének elé.
Normális oxigénellátottságú körülmények között a Hif1β stabil, míg a Hif1α fehérjét az ubiquitin–proteaszóma rendszer lebontja, ezzel megakadályozva a transzkripciót. A Hif1α oxigén-függő szabályozásának a kulcsa a VHL komplexum. A HIF1α konzervatív helyzetű prolin aminosavain hidroxilálódik a HIF-prolil-hidroxiláz segítségével.
Ez elősegíti, hogy VHL ubiquitin ligáz felismerje és ubiquitinilálja, ami gyors degradációját okozza a proteaszómában. Mindez csak normális oxigén ellátottság mellett zajlik így. Hipoxiás körülmények között a HIF-prolil-hidroxiláz gátlódik, mert az oxigént ko-szubsztrátként használja az aktivitása során.
A 2.28. ábra az SCF típusú sok alegységes RING-finger E3-as enzimeket hasonlítja össze.
2.28. ábra Az SCF típusú sok alegységes RING-finger E3-as enzimek összehasonlító ábrája.A specificitást adó molekula részleteket (F-box, VHL, BTB, DDB1/2, SOCS-box) különböző cullinok kötik a RING-finger fehérjéhez (RBX). Az egyes cullinok egyedi, de szerkezetileg hasonló specificitást adó fehérjéket használnak. (Az ábrán használt rövidítések: β-TRCP, β-transducin repeat-containing protein; BTB, broad complex/tracktrack/bric-a-brac; DDB, DNA-damage binding protein; FBW, F-box and WD40 domain protein; HECT, homologous to E6-AP COOH-terminus; RBX, RING-box protein; SCF, SKP1–Cullin–F-box; SKP, S-phase kinase-associated protein;
VHL, von Hippel-Lindau) Anafázis promóciós komplexum
• mitotikus orsóban lokalizál
• metafázis-anafázis átmenet elősegítése
• ciklin B lebontás
Az APC (anaphase promoting complex, másnéven cyclosome) a legösszetettebb SCF típusú sok alegységes ubiquitin ligáz, mely a mitotikus orsóban található a sejtosztódás idején. Szubsztrátjait a Cdc20 és Cdh1 specifikus aktivátorokon keresztül köti meg. Az APC komplexum fehérjéi a legnagyobbtól indulva sorban a legkisebbig vannak beszámozva (Apc1-10, 2.29. ábra).
2.29. ábra Az anafázis promóciós komplexum(APC vagy cyclosome) nevű E3-as enzim alegységösszetételének egyszerűsített rajza
Az Apc2 fehérje egy cullin homológ, az Apc11 egy RING-finger fehérje. Az Apc3/Cdc27, Apc6/Cdc16 és Apc8/Cdc23 fehérjék külön komplexumot formálnak atetratricopeptide repeat(TPR) doménjük segítségével és valószínűleg a komplexum megtámasztására szolgálnak. Az Apc1 azAspergillusBimE proteinjének homológja.
Az Apc4, Apc5, Apc7 és jópár más alegység szerepe egyelőre ismeretlen.