Mdm2-függő p53 export.Az első modell szerint az Mdm2 hozzáköt a p53-hoz a sejtmagban és kiviszi a p53-at a citoplazmába (5.10. ábra). Ez a modell arra a megfigyelésre épül, hogy az Mdm2 egy belső magi export szignál (NES) segítségével kerül ki a magból a citoplazmába. Ennek mutációja megszünteti az Mdm2 nukleáris exportját és a p53 lebontó képességét is. Megerősíti ezt a modellt, hogy az Mdm2 magi lokalizációs jelének (NLS) mutációja kizárja a magba jutásból és ugyancsak megakadályozza a p53 degradálásában. Különböző sejtvonalak LMB-vel történő kezelése megnövelte a p53 fél-életidejét és egyensúlyi mennyiségét. Az LMB kovalens kötést alakít ki a CRM1 (exportin 1) egyik konzervatív cisztein oldalláncával, ami a fehérjék magi export jelének evolúciósan konzervált receptora és ezáltal megszünteti a CRM1-NES kötődést. Az LBM kezelés meggátolta az E6-E6AP közvetítette p53 lebontást a human papillomavírus fertőzött sejtvonalakban, megmutatva, hogy a p53 kikerülése a magból szükséges bármelyik ubiquitin ligáz útján történő lebontáshoz, de a folyamat nem teljesen Mdm2-függő (Zhang és Xiong, 2001).
5.10. ábra A p53 Mdm2 közvetített lebontási modelljei normális sejtműködés esetén. SM, sejtmag; C, citoplazma.
Mdm2 független, önálló p53 export.A második modell szerint a p53 maga is tartalmaz egy működőképes magi export jelet (NES), ami lehetővé teszi számára a magból való kijutást (5.10. ábra). A magba injektálás után a fluoreszcensen jelölt p53 egy energiafüggő útvonalon perceken belül kikerült a magból, az NLS-sel jelölt humán szérum albumin azonban nem. A humán p53-ban azonosítottak egy leucin gazdag NES-t, mely a 339-352 aminosavak között húzódik. Ennek mutációja megakadályozta a p53 exportját a magból. A p53 NES szekvenciáját fuzionáltatták egy egyébként magban lokalizáló BSA fehérjéhez (p53 339–352-BSA), ami a fehérje citoplazmatikus felhalmozódását eredményezte LMB szenzitív módon. Az Mdm2 független p53 magi export modellt támasztja alá az a megfigyelés is, hogy egy p53-GFP fúziós fehérje egyaránt előfordult a magban és a citoplazmában miután kifejeztették a p53 2/2-MDM2 2/2 kettősen hiányos MEF sejtekben, míg a p53 NES szignálban történt mutációk a p53-GFP kizárólag magi elhelyezkedését eredményezték. Mivel a NES szignál a p53 tetramerizációs doménjében található, feltételezték, hogy a p53 szabályozott tetramerizációja eltakarja a NES szignált és ezzel biztosítja a p53 visszatartását DNS kötő formájában a magban.
Ubiquitiniláció-függő p53 export.A harmadik modell szerint az Mdm2 ubiquitinilálja a p53-at a sejtmagban és a p53 multiubiquin lánca segíti a magi exportot és az ezt követő citoplazmatikus degradációt (5.10. ábra). Ez a modell olyan megfigyelések alapján készült, melyek szerint az Mdm2 és a p53-GFP fúziós fehérje együttes kifejeztetése a fúziós fehérje citoplazmatikus felhalmozódásával, sőt magi kizáródásával járt. A p53-GFP Mdm2 okozta kizáródása a magból megszűnt az Mdm2 RING-finger doménjének mutációjával, ami inaktiválta az ubiquitin ligáz aktivitását vagy az E1 ubiquitin aktiváló enzim mutációjának hatására. A modellt igazolja, hogy a magi export blokkolása LMB kezeléssel az ubiquitinilált p53 felhalmozódását eredményezte a magi frakcióban. Ezenkívül a p53 C-terminálisán levő NES-ben okozott mutációk meggátolták a p53 magi exportját, de az ubiquitinilációt nem. Mindez azt mutatja, hogy a p53 ubiquitinilációja a magban zajlik még a citoplazmába való export előtt (Zhang és Xiong, 2001).
Az ARF p53 stabilizálásában betöltött szerepének három modellje.Függetlenül attól, hogy a magi p53 az Mdm2 segítségével, vagy magától, esetleg az Mdm2 közvetítette ubiquitiniláció útján kerül ki a sejtmagból a citoplazmába, a p53 magi exportjának blokkolása vagy az Mdm2-p53 komplexum szétszedése a p53 stabilizációját okozza. Az ARF fehérje gátolja a p53 Mdm2 közvetítette degradációját, legalábbis részben, a p53 és Mdm2 magi exportjának megakadályozásával. Jelenleg három modell próbálja a p53 Mdm2 közvetítette magi export ARF általi gátlásának molekuláris mechanizmusát megmagyarázni:
a. az Mdm2 elkülönítése a sejtmagvacskába;
b. ARF-Mdm2-p53 hármas komplexum kialakítása a nukleoplazmában;
c. az Mdm2 ubiquitin ligáz aktivitásának gátlása a sejtmagban.
Mindegyik modellnek van kísérletes alapja, de egyik sem tudja megnyugtatóan integrálni az összes megfigyelést.
A modelleket az 5.11. ábrán vetjük össze.
5.11. ábra Az ARF közvetített Mdm2 gátlás és p53 aktiváció három modellje onkogén hatás esetén.SM, sejtmag; C, citoplazma; sm, sejtmagvacska.
Az Mdm2 elkülönítése a sejtmagvacskába. Az első modell szerint az ARF az Mdm2-t a nukleoplazmából a magvacskába viszi, felszabadítva a p53-at az Mdm2 gátlása alól és ezzel lehetővé téve felszaporodását a sejtmagban (5.11. ábra). Ez a modell két megfigyelésen alapszik: az Mdm2 fehérje molekulák egy része, nem az összes, a nukleóluszokban található Mdm2-t és egér et kifejező plazmidokkal transzfektált HeLa sejtekben, egér ARF-et kódoló plazmiddal mikroinjektált egér embrionális fibroblaszt (MEF) sejtekben, és öregedő MEF sejtekben, melyekben mind az Mdm2, mind az ARF szint megemelkedik. A másik adatsor szerint az egér ARF mutáns (ARF D26-37) nem tud a magvacskába kerülni, ugyan megtartja az Mdm2 kötő aktivitását, mégsem tudja az Mdm2-t a magvacskába vinni, így a p53 stabilizáló képessége is csökken.
ARF-Mdm2-p53 hármas komplexum.A második modell az mutatja, hogy az ARF áthelyeződik az Mdm2 hatására a sejtmagvacskából a nukleoplazmába, és itt egy háromtagú komplexumot alakít ki az Mdm2-vel és a p53-mal, ezzel megakadályozva mind az Mdm2, mind a p53 magi exportját (5.11. ábra). Ha csak az ARF és a p53 fejeződik ki együtt, az Mdm2 hiányában sem az ARF sejtmagvacskába kerülése, sem a p53 eloszlása a nukleoplazma területén nem változik, egybevágóan azzal a megfigyeléssel, hogy az ARF az Mdm2 gátlásával lép kölcsönhatásba a p53-mal. Az Mdm2 kifejeztetése HeLa sejtekben, melyek nagy mennyiségben termelték az ARF-et a p53 működésének szünetelése miatt, az ARF átrendeződését eredményezte az egész nukleoplazmában. Ha mindhárom fehérjét egyszerre kifejeztették, az ARF, az Mdm2, és a p53 különálló magi testekbe került a nukleoplazmában. Az ARF exon 1β által kódolt Mdm2 kötő domén kivágódása vagy a magba vagy sejtmagvacskába irányító jelek mutációja a humán ARF exon 2 régiójában megszüntetik az ARF azon képességét, hogy magi testeket formáljon és csökkentik a p53 stabilizáló aktivitását. Ezek a tények összekapcsolják a hármas komplexum illetve magi testek formálását és az ARF közvetített p53 stabilizációt. Az E2F1, az ARF gén aktivátorának expressziója normális vagy Mdm2 gén amplifikált sejtekben az ARF felhalmozódását okozta a nukleoplazmában. A Saos-2 sejtekben azonban, melyek p53 hiányosak és rendkívül alacsony az Mdm2 szintjük, kizárólag a sejtmagvacskában lokalizált az ARF. Mindez élettani bizonyítékot szolgáltat arra, hogy az Mdm2 képes megváltoztatni az ARF lokalizációját és képes magi testek kialakulását kiváltani ARF és p53 jelenlétében.
A p53 sejtmagi ubiquitinilálásának gátlása.A harmadik modell szerint az Mdm2 a p53-at a sejtmagban ubiquitinilálja és ez a jel elősegíti, sőt szükséges a p53 magi exportjához és az ezt követő citoplazmatikus lebontáshoz. Mivel az ARF-fel való kapcsolódás gátolja az Mdm2 ubiquitin ligáz aktivitását, az ARF megakadályozhatja a p53 magból történő kijutását a p53 Mdm2 közvetítette magi ubiquitinilálásának gátlásával (5.11. ábra). Ez a modell azokra a kísérletekre épül, melyek az Mdm2 és a p53-GFP együttes kifejeződését mutatják, nem pedig egyedül a p53-GFP-jét, és ez a p53-GFP citoplazmatikus felhalmozódását eredményezi vagy egyes sejtekben a magból való kizárását.
Ezt a megfigyelést az Mdm2 közvetített p53 magi export bizonyítékának tekintették. A p53-GFP áthelyeződését megszüntette az Mdm2 RING-finger doménjének egy mutációja (HDM2 C464A), mely inaktiválta az ubiquitin ligáz aktivitását, illetve az ubiquitin aktiváló enzim (E1) egy hőmérséklet-szenzitív mutációja. Összhangban ezzel a modellel, a magi export gátlása LMB kezeléssel jelentős mennyiségű ubiquitinilált p53 felhalmozódásához vezetett a magfrakcióban a citoplazma frakcióhoz viszonyítva, ami arra utal, hogy az ubiquitiniláció a magban, a citoplazmába átkerülés előtt történhet (Zhang és Xiong, 2001).
A p53 a gyógyításban
Az a megfigyelés, hogy a p53 a legtöbb rákbetegségben hibás, nem működik, igen alkalmas célponttá teszi új gyógymódok kidolgozásához. Mivel a p53 indukálhatja a tumorsejtek pusztulását, a legintenzívebben kutatott lehetőség, hogy olyan kis molekulát találjanak, mely egyes rák fajtákban újra aktiválja a p53-at. Olyan rákok esetén, ahol megmarad a vad típusú p53, de olyan változtatások történtek, melyek megakadályozzák a p53 aktiválódását, jó pár az Mdm2-t célba vevő vegyületet leírtak. Ezek közé tartozik a Nutlin-3, amelyik blokkolja a p53 és az Mdm2 kapcsolódását, és a HLI98 amelyik közvetlenül blokkolja az Mdm2 ubiquitin ligáz aktivitását. Ezek a vegyületek természetesen a normális és a tumor sejtekben egyaránt aktiválják a p53-at, de az a megfigyelés, hogy a rákos sejtek sokkal érzékenyebbek az apoptózis stimulálására, mint az egészséges sejtek, megcsillantja a reményt, hogy ezek a vegyületek elég szelektíven pusztítják a sejteket ahhoz, hogy használható rákellenes szerek váljanak belőlük.
Azok a rákbetegségek, melyekben mutáns a p53, más megközelítést igényelnek. Már leírtak olyan vegyületeket, melyek segítenek egyes ilyen mutáns fehérjéknek annyira újrahajtogatódni, hogy legalább a normális funkcióik egy részét visszanyerjék. A legtöbb esetben csak a tumorsejtek fejezik ki a mutáns fehérjét, így valószínű, hogy a gyógyszermolekulák erősen szelektívek lesznek, és alacsony toxicitást fejtenek ki a normális szövetekre. Erre az
esetre egy másik érdekes megközelítés, hogy azt próbálják szelektíven kihasználni , hogy tumorsejtekben nincs p53 és olyan vegyületeket találni, melyek p53 hiányában pusztítják el a sejtet (úgynevezett szintetikus letalitás).
Bár a p53 aktiválása is jó ötlet, egyre nagyobb az érdeklődés a p53 gátlása iránt. A nyilvánvaló célja ennek a megközelítésnek, hogy megvédjék a normális sejteket a kemoterápia mellékhatásaitól. Általánosabban az inhibitorok a p53 más káros hatásait is kiküszöbölik.
A p53 útvonalon további gyógyszercélzási hely is adódik, a legalkalmasabb a p53 fő ubiquitin ligáza, az Mdm2 (5.12. ábra).
5.12. ábra A p53 aktiválása a proteaszóma gátlásával a rákgyógyításban
Az Mdm2 kifejeződését a p53 maga serkenti, ezzel egy negatív visszacsatolású szabályozó kört alakít ki. Ebből logikusan következik, hogy az Mdm2-p53 kölcsönhatás illetve a p53 ubiquitinilációjának gátlása a p53 tumor elnyomó aktivitásának erősödéséhez vezet. Az Mdm2 gátlása nemcsak a hibátlan, vad típusú p53-at hordozó tumorok esetén lehet kedvező hatású, hanem az Mdm2 más rákellenes fehérjéket bontó szerepét is megakadályozza.
Ehhez hasonlóan alkalmazhatunk proteaszóma gátlószereket az olyan ráktípusok ellen is, melyek túl sok Mdm2-t fejeznek ki és ezálMdm2-tal inakMdm2-tiválják a p53-aMdm2-t (Adams, 2004).
Most még nehéz lenne megmondani a pontos okát annak, hogy egyes sejtek miért érzékenyek a proteaszóma gátlásra és mások miért nem. Egy lehetséges magyarázat szerint sok tumor gyors osztódási üteme függővé teszi ezeket a sejteket a proteaszómától, mely eltávolítja a megnövekedett számú sérült vagy rosszul hajtogatott fehérjét.
Egy másik, még elegánsabb, mechanizmus az lehet, hogy a proteaszóma aktivitásának gátlása megfordíthatja vagy áthidalhatja a mutáns sejtciklus vagy apoptotikus ellenőrző pontokat, melyek a rákos fenotípus kialakulásában vagy fenntartásában szerepet játszanak. Ezért van tehát szükség a komplex ubiquitinilációs rendszer minél jobb megismerésére, mert új rákgyógyítási eljárásokhoz vezethet, melyek felcsillantják a reményt jobb és tökéletesebb gyógyítási eredmények elérésére a rosszindulatú és más daganatos betegségek kezelésére.