A RING-finger domént tartalmazó ubiquitin ligázok családjának tagjai állhatnak egyetlen polipeptid láncból, működhetnek dimerként vagy felépülhetnek több alegységből. Nézzük meg közelebbről a névadó RING-finger domén szerkezetét.
RING-finger domén
• ~60 aminosav hosszú szerkezeti egység
• 2 vagy 3 cinkion stabilizálja
Az emlős genom több mint 600 lehetséges RING-finger E3-as enzimet kódol. A legtöbb RING-finger domén két cinkiont tartalmaz (sárga), melyeket 4 cisztein vagy 3 cisztein és 1 hisztidin oldallánc (piros) stabilizálnak. A d o m é n á l t a l á n o s k o n s z e n z u s a m i n o s a v s z e k v e n c i á j a a k ö v e t k e z ő : C-X2-C-X9–39-C-X1–3-H-X2–3-C-X2-C-X4–48-C-X2-C, de más variáció is létezik (2.20. ábra).
2.20. ábra A RING-finger domén alapszerkezete(C3HC4-típus)
A két cinkion és az őket tartó aminosavak egy átkaroló szerkezetet formáznak. A RING-finger doménnek két változata van, a C3HC4-típus és a C3H2C3-típus, melyek nagyon hasonlóak, csak a cisztein/hisztidin mintázatukban különböznek. Az utóbbi típust szokták RING-H2-fingernek is hívni. AzU-boxelnvezésű domén hasonló szerkezet, de nincs benne cinkion (Nalepa és mtsai., 2006).
Egy alegységből felépülő RING-finger domént tartalmazó ligázok
A RING-finger család egyes tagjai egyetlen polipeptidből állnak. Ilyen molekula az Mdm2 illetve egyes IAP fehérjék. Ezek a fehérjék a RING-finger domén részükkel közvetlenül kötok a megfelelő E2-es enzimet és egy másik részükkel pedig a szubsztrát fehérjét (2.21. ábra).
2.21. ábra Egy alegységből felépülő RING-finger típusú ubiquitin ligáz (E3).A piros ellipszis a RING-finger domént jelöli.
Gyakori azonban, hogy ezek a monomer ubiquitin ligázok kettesével, a RING-finger doménjükkel vagy az akörüli régióval összekapcsolódnak, homodimereket hoznak létre. Ilyen például a cIAP (cellular inhibitor of apoptosis,
Képződhetnek heterodimerek is, erre jó példa az Mdm2 (murine double minute 2, emberben Hdm2) és az MdmX (másnéven Mdm4, illetve emberben HdmX vagy Hdm4) összekapcsolódása, vagy a BRCA1 (breast cancer 1) és BARD1 (BRCA1-associated RING domain 1) együttese. Heterodimerek esetén az egyik RING-domén fehérjének (MdmX, BARD1) gyakran hiányzik a ligáz aktivitása és csak stabilizálja az aktív E2-kötő RING-domént.
SCF komplexum
A legismertebb több alegységes RING-finger domén ubiquitin ligáz enzimek az SCF komplexum típusba tartoznak.
Az SCF rövidítés a legfontosabb alegységek kezdőbetűiből áll össze: Skp1, cullin, F-box (2.22. ábra).
2.22. ábra Az SCF komplexum típusútöbb RING-finger domén ubiquitin ligáz enzim alegységei
Az SCF komplexum a cullint tartalmazó ubiquitin ligázok alaptípusa. A ligáz a szubsztrátfehérjét az egyik alegységének fehérje-kötő doménjével, a 45 aminosavból állóF-box-szal köti meg. Legalább három osztálya van az F-box fehérjéknek, aszerint hogy milyen a szubsztrátkötő részük:Fbw(WD40 - egy rövid kb. 40 aminosavból álló szakasz, gyakran a Trp-Asp (W-D) dipeptidre végződik),Fbl(LRR - leucine-rich repeat),Fbx. Az F-box protein azSkp1(S-phase kinase associated protein) fehérjéhez kapcsolódik, ami adapterként vagy zsanérként a cullinhoz köti. A cullin (cull (ang.): összeszed) állványfehérje a komplexum vázszerkezeteként szolgál és másik végén a RING-finger fehérjét (Roc1/Rbx1)tartja, az pedig egy specifikus E2 enzimhez kapcsolódik (2.22. ábra).
Láthatjuk, hogy egy SCF komplexum specificitását elsősorban a szubsztrát felismerő és megkötő F-box fehérje adja. Ezért egy adott enzim megnevezésekor az SCF rövidítés mellé felső indexként az F-box fehérje nevét írják.
Például, ha az F-box az Fbl1 osztályba tartozóSkp2, akkor SCFSkp2lesz az enzim jele (Petroski és Deshaies, 2005) (2.23. ábra).
2.23. ábra Az SCFSKP2térszerkezete
Egy másik példában az F-box fehérje az Fbw1 osztályba tartozó, 7-szeres WD40 szakaszt tartalmazóβ-Trcp1 (β-Transducin repeat containing protein), a komplexum elnevezése: SCFβTrCP(2.24. ábra).
2.24. ábra Az SCFβTrCPE3 enzim térszerkezete egy lebontandó peptiddel
A szubsztrát fehérje ubiquitinilálását gyakran a szubsztrát fehérje poszttranszlációs módosítása, így hiperfoszforiláció vagy hidroxiláció előzi meg. A különös foszforiláltsági mintázat az egyik jel az E3-as enzim számára a fehérje ubiquitinilálására. Ez játszódik le az SCFβTrCPE3 ligáz két természetes szubsztrátja, az IκB és a β-catenin esetén is.
RING E3 enzim közvetített katalízis mechanizmusa
Az SCFβTrCPE3-as enzim ubiquitinilálási sebessége jelentősen függ az ubiquitinilálandó lizin és az enzim által a szubsztráton felismert ún. destrukciós motívum közötti távolságtól. Ennek vizsgálatára in vitro kísérletben vad típusú és módosított β-catenin és IκBα peptideket használtak (2.25. ábra).
2.25. ábra Az SCFβTrCPE3-as enzim aktivitásának méréséhez használt vad típusú és módosított β-catenin és IκBα peptidek.Az ábrán a destrukciós motívum sárgával jelölt, az ubiquitint fogadó lizinek rózsaszínnel a vad típusú peptidhez képest beillesztett aminosavak a wt+4 és wt+8 mutáns β-catenin peptidek esetén zöldek.
Mint az ábrán látható a két természetes szubsztrátban eltérő a távolság a lizin és a destrukciós motívum között, az IκBα-ban pontosan négy aminosavval rövidebb, mint a β-cateninben. A kísérletben létrehozott módosított β-catenin peptidekben a vadtípusnál 8 illetve 4 aminosavval rövidebb valamint 8 illetve 4 aminosavval hosszabb volt ez a távolság (Wu és mtsai., 2003).
Bár az SCFβTrCPE3-as enzim felismeri mindkét természetes szubsztrátját, a kísérlet kimutatta, hogy az IκBα-t nagyobb aktivitással ubiquitinilálja, mert itt éppen megfelelő az enzim számára a fogadó lizin és a felismert destrukciós motívum közötti távolság. Ha a β-cateninben mesterségesen lerövidítették ezt a távolságot, jobb ubiquitinilálási sebességet kaptak a vadtípushoz képest. Minden más változtatás csak gyengébb aktivitást eredményezett (2.26. ábra).
2.26. ábra Az SCFβTrCPubiquitinilálási sebessége függ a szubsztrátpeptid lizinje és a destrukciós motívuma közötti távolságtól.A grafikon az ubiquitinilált peptid / összes ubiquitin arány időbeli változását mutatja. Négy párhuzamos kísérlet átlaga illetve standard deviációja szerepel az ábrán.
VBC komplexum (VHL-ElonginB-ElonginC)
• von Hippel-Lindau tumor szupresszor protein
• VHL disease – sporadikus vese karcinóma
• a Hif1α-t és Hif2α-t (hypoxia indukálható transzkripciós faktor) bontja, mely a VEGF-t (vascular endothelial growth factor) szabályozza
A VBC (VHL-elongin B-elongin C) komplexumot a VHL (von Hippel-Lindau) tumor-szuppresszor fehérjével együtt fedezték fel. Az E3-as enzim szubsztrátja, a Hif1α transzkripciós faktor a SOCS box-ot (suppressor of cytokine signalling) tartalmazó VHL fehérjéhez kötődik. A SOCS box az Skp1-hez hasonló elongin C-hez és az ubiquitin homológ elongin B-hez. A komplexum tagja még a Cul2 cullin és a Roc1/Rbx1 RING-finger protein (2.27. ábra).
2.27. ábra A VBC komplexum vázlata
Az angiogenezis (érképződés) a tumor növekedés és előretörés alapja. Ennek kulcsszabályozója a hipoxia indukálható faktor (HIF) transzkripciós faktor család, melyek a bioenergetikában, sejt növekedésben és érképződésben érintett gének átíródását indukálják. Hipoxiás körülmények között a HIF fehérjék közül a Hif1α és Hif1β aktív és heterodimert képezve a hipoxia válasz génekhez (hypoxia response elements – HREs) kötődnek a célgének elé.
Normális oxigénellátottságú körülmények között a Hif1β stabil, míg a Hif1α fehérjét az ubiquitin–proteaszóma rendszer lebontja, ezzel megakadályozva a transzkripciót. A Hif1α oxigén-függő szabályozásának a kulcsa a VHL komplexum. A HIF1α konzervatív helyzetű prolin aminosavain hidroxilálódik a HIF-prolil-hidroxiláz segítségével.
Ez elősegíti, hogy VHL ubiquitin ligáz felismerje és ubiquitinilálja, ami gyors degradációját okozza a proteaszómában. Mindez csak normális oxigén ellátottság mellett zajlik így. Hipoxiás körülmények között a HIF-prolil-hidroxiláz gátlódik, mert az oxigént ko-szubsztrátként használja az aktivitása során.
A 2.28. ábra az SCF típusú sok alegységes RING-finger E3-as enzimeket hasonlítja össze.
2.28. ábra Az SCF típusú sok alegységes RING-finger E3-as enzimek összehasonlító ábrája.A specificitást adó molekula részleteket (F-box, VHL, BTB, DDB1/2, SOCS-box) különböző cullinok kötik a RING-finger fehérjéhez (RBX). Az egyes cullinok egyedi, de szerkezetileg hasonló specificitást adó fehérjéket használnak. (Az ábrán használt rövidítések: β-TRCP, β-transducin repeat-containing protein; BTB, broad complex/tracktrack/bric-a-brac; DDB, DNA-damage binding protein; FBW, F-box and WD40 domain protein; HECT, homologous to E6-AP COOH-terminus; RBX, RING-box protein; SCF, SKP1–Cullin–F-box; SKP, S-phase kinase-associated protein;
VHL, von Hippel-Lindau) Anafázis promóciós komplexum
• mitotikus orsóban lokalizál
• metafázis-anafázis átmenet elősegítése
• ciklin B lebontás
Az APC (anaphase promoting complex, másnéven cyclosome) a legösszetettebb SCF típusú sok alegységes ubiquitin ligáz, mely a mitotikus orsóban található a sejtosztódás idején. Szubsztrátjait a Cdc20 és Cdh1 specifikus aktivátorokon keresztül köti meg. Az APC komplexum fehérjéi a legnagyobbtól indulva sorban a legkisebbig vannak beszámozva (Apc1-10, 2.29. ábra).
2.29. ábra Az anafázis promóciós komplexum(APC vagy cyclosome) nevű E3-as enzim alegységösszetételének egyszerűsített rajza
Az Apc2 fehérje egy cullin homológ, az Apc11 egy RING-finger fehérje. Az Apc3/Cdc27, Apc6/Cdc16 és Apc8/Cdc23 fehérjék külön komplexumot formálnak atetratricopeptide repeat(TPR) doménjük segítségével és valószínűleg a komplexum megtámasztására szolgálnak. Az Apc1 azAspergillusBimE proteinjének homológja.
Az Apc4, Apc5, Apc7 és jópár más alegység szerepe egyelőre ismeretlen.