Az egyik legfontosabb kérdés az autofágia vizsgálata során az, hogy egy adott kezelés vagy genetikai manipuláció milyen hatással van az autofág lebontásra. A fent felsorolt módszerek többsége csak egy pillanatfelvételt szolgáltat a vizsgált folyamatról, és ezek alapján nem mindig egyértelmű a következtetés. Ha például egy adott kísérletben minden jel arra mutat hogy megnőtt az autofagoszómák száma, akkor ezt okozhatja korai indukció (több autofagoszóma keletkezés) vagy későbbi gátlás (ugyanannyi autofagoszóma keletkezik mint a kontroll sejtekben, de azok például nem fúzionálnak lizoszómákkal, ezért felhalmozódnak). Ezért mindig elegedhetetlen az autofág fluxus (azaz hogy mennyi anyag „folyik keresztül” az autofág útvonalon) vizsgálata. A folyamatot tehát lehetőség szerint teljes egészében kell vizsgálnunk, tehát a bemenet (autofagoszóma keletkezés) és a kimenet (autolizoszómális lebontás) mértékét és arányát is meg kell határoznunk.
Az egyik leggyakrabban alkalmazott technika a mikroszkópban látható Atg8/LC3 pöttyök számának, vagy western blot alapján a lipidált forma mennyiségének meghatározása lizoszómális lebontást gátló szer (mint a fent említett bafilomicin vagy klorokvin, vagy az E64 és pepsztatin kombinációja) nélkül és annak jelenlétében. Ezek a gátlószerek az autofág lebontást megakadályozzák, így megnövelik mind az Atg8/LC3 pöttyök számát, mind pedig a lipidált fehérjemennyiséget (9.19-9.21. ábrák).
9.19. ábra mCherry-Atg8a riportert expresszáló muslica lárvák zsírteste. Jól táplált állatokban az autofagoszómákat és autolizoszómákat jelölő mCherry-Atg8a riporter nagyon kevés pöttyöt mutat. Pircs Karolina felvétele.
9.20. ábra mCherry-Atg8a riportert expresszáló, klorokvin kezelt muslica lárvák zsírteste.Jól táplált állatok több napig tartó klorokvin kezelése rengeteg mCherry-Atg8a pozitív autofág struktúra felhalmozódásához vezet.
Pircs Karolina felvétele.
9.21. ábra Lizoszómális gátlószer kezelés hatása a lipidált LC3 szintjére.Humán sejttenyészeti kísérletekben az éhezés megnöveli a lipidált LC3 II mennyiségét. Mivel az LC3 az autofágia során lebomlik, a lizoszómális enzimeket gátló E64d/pepsztatin A kezelés hatására felhalmozódik. Forrás: Mol. Biol. Cell 2012; 23 (5): 896-909 Amennyiben a vizsgált sejtben már eleve gátolt volt a lizoszómális lebontás, akkor viszont ezeknek a kezeléseknek elvileg nincs hatásuk. Sajnos azt egyelőre kevesen veszik figyelembe, hogy a TOR aktivitását csökkentheti a lizoszómális lebontás gátlása, emiatt maga a fluxus meghatározását célzó drogkezelés nem csak a lebontást, hanem az autofagoszóma keletkezést is befolyásolhatja (Juhasz, 2012).
Egy másik megközelítés azon alapul, hogy a lizoszóma az autofágia során szelektíven bekerülő fehérjéket lebontja.
Ilyen protein például az Atg8/LC3, és az ehhez erősen kötő specifikus szállítmány, a p62 is. Ez a GFP-vel vagy mCherry-vel fúzionált riporterekre is igaz, viszont ezek a fluoreszcens fehérjerészek a lizoszómában kompakt térszerkezetük miatt jóval lassabban bomlanak le. Tehát western blot segítségével követhető, hogy mennyi GFP-LC3 vagy GFP-p62 bomlik le, mivel ez a lizoszómális proteolízis következtében keletkező, a lebomlott GFP-LC3 vagy p62 nélküli szabad GFP mennyiségével arányos (9.22. ábra).
9.22. ábra A GFP-fúziós p62 riporteren alapuló konverziós esszé. Autofágia indukciójakor a p62-GFP molekula p62 része gyorsan lebomlik, míg a lizoszómális degradációnak jobban ellenálló szabad GFP megjelenik a western blot kísérletekben. Ezen a képen az éheztetett (4) és vándorló (W) állatokban látható szabad GFP a táplálkozó (0) állatokban nem mutatható ki. Forrás: PLoS One. 2012; 7(8): e44214.
Ezt a technikát konverziós esszének nevezik, mivel a fúziós fehérje a lizoszómális emésztés következtében szabad GFP-vé vagy mCherry-vé alakul. Az Atg8/LC3 és a p62 fúziós riporterei mikroszkópos szinten is felhasználhatóak fluxus vizsgálatokra. Ehhez dupla, GFP és mCherry cimkét egyaránt hordozó riportereket használnak. Ezek a fúziós fehérjék a lizoszómába jutnak, ahol azonban a GFP fluoreszcenciája a savas pH hatására kialszik, az mCherry-vel ellentétben. Tehát például az mCherry-GFP-Atg8 riportert használva az autofagoszómák sárgák (egyszerre zöldek és pirosak), míg az autolizoszómák inkább pirosak (csak mCherry-pozitívak) lesznek (9.23. ábra).
9.23. ábra Az mCherry-GFP-Atg8a riporter felhasználása autofág fluxus vizsgálatára.Az mCherry-GFP-Atg8a riportert expresszáló muslica lárvák zsírtestében rövid idejű éhezés során főként apró, sárga (mCherry és GFP pozitív) autofagoszómák láthatók (bal oldali panel). Hosszú ideig tartó éhezés esetén viszont a piros, csak mCherry fluoreszcenciát mutató autolizoszómák jelenléte jellemző (jobb oldali panel). Nagy Péter felvételei.
Összegzésül elmondható, hogy vizsgálataink során célszerű minél többféle kísérleti megközelítéssel vizsgálódni,
autofágiára nézve. Ezért is készült el nemrégiben egy, az autofágiával foglalkozó kutatók nagy részének részvételével megfogalmazott új ajánlás, amely a fenti módszerek tárgyalása mellett egyéb metodikákat is részletesen leír (Klionsky és mtsai, 2012).
Ellenőrző kérdések
1. Az Atg fehérjkomplexek közül melyek szerepelnek a fagofór kialakulás kezdeti, és melyek akésőbbi lépéseiben?
2. Fluoreszcens mikroszkóppal hogyan vizsgálható az autofágia?
3. Milyen jellegzetes morfológiát mutatnak a különféle autofág struktúrák az elektronmikroszkópos felvételeken?
4. Milyen biokémiai módszerrel és hogyan vizsgálható az autofágia?
5. Mi az egyik legerősebb (bár indirekt) bizonyíték arra, hogy az autofágia egy adott folyamatban szerepel?
6. Miért szükséges, és hogyan vizsgálható az autofág fluxus?
Irodalom
Eskelinen, E. L., Reggiori, F., Baba, M., Kovacs, A. L. és Seglen, P. O.(2011). Seeing is believing: the impact of electron microscopy on autophagy research.Autophagy 7, 935-956.
Itakura, E. és Mizushima, N.(2010). Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.Autophagy 6, 764-776.
Juhasz, G.(2012). Interpretation of bafilomycin, pH neutralizing or protease inhibitor treatments in autophagic flux experiments: novel considerations.Autophagy 8, 1875-1876.
Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T., Yamamoto, A., Kirisako, T., Noda, T., Kominami, E., Ohsumi, Y. és Yoshimori, T.(2000). LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.EMBO J.19, 5720-5728.
Klionsky, D. J. Abdalla, F. C. Abeliovich, H. Abraham, R. T. Acevedo-Arozena, A. Adeli, K. Agholme, L.
Agnello, M. Agostinis, P. Aguirre-Ghiso, J. A. és mtsai (2012). Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.Autophagy 8, 445-544.
Kovacs, A. L., Rez, G., Palfia, Z. és Kovacs, J.(2000). Autophagy in the epithelial cells of murine seminal vesicle in vitro. Formation of large sheets of nascent isolation membranes, sequestration of the nucleus and inhibition by wortmannin és 3-methyladenine.Cell Tissue Res.302, 253-261.
Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T. és Ohsumi, Y.(2004). In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.Mol.
Biol. Cell15, 1101-1111.
Scott, R. C., Schuldiner, O. és Neufeld, T. P.(2004). Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body.Dev. Cell 7, 167-178.
Suzuki, K., Kubota, Y., Sekito, T. és Ohsumi, Y. (2007). Hierarchy of Atg proteins in pre-autophagosomal structure organization.Genes Cells 12, 209-218.