A bevezetés nem lehet teljes anélkül, hogy visszatérnénk az izoláló, vagy szekvesztráló membrán keletkezésének problémájára. A kérdés mind a mai napig élénken vitatott, és nincs rá kísérletileg igazolt, mindenki által elfogadott, magyarázat. A probléma körüli polémia tanulságos példája a hipotézisek és a tények kezelésének a tudományos diszkussziókban.
A szekvesztráció folyamatát az 1990-es évek közepéig csak elektronmikroszkóppal lehetett vizsgálni. Amint azt már említettük, az 1960-as években tisztázták, hogy a folyamat elején a kettős membránnal határolt autofág vakuólák, az autofagoszómák állnak. A dupla membrán két lemeze között általában tágult, üresnek látszó tér mutatkozott, ami ciszternaszerű megjelenést okozott (1.44. ábra).
1.44. ábra Autofagoszómák (baloldalon és középen) és nyitott izoláló membránok (fagofórok, jobb oldalon). Mind az autofagoszómák, mind a fagofórok kettős membránja között üresnek látszó tér mutatkozik, ami fixálási műtermék ugyan, de olyan rendszeresen és jellegzetesen mutatkozik, hogy a rutinszerűen alkalmazott aldehiddel fixált mintákban felhasználható a korai autofág struktúrák (fagofórok, autofagoszómák) azonosítására (egér ondóhólyag hámsejt)
Emiatt a kézenfekvő és a leggyakrabban hangoztatott, fentebb már említett, elképzelés az volt, hogy az izoláló membrán a RER direkt transzformációjával keletkezik. A RER mellett az izoláló membrán (IM) forrásaként szóba került szinte az összes sejtben található membrán típus, így a pl. a Golgi-vezikulák (Locke és Collins, 1965), a sima endoplazmás retikulum (Arstila és Trump, 1968), vagy akár a plazma membrán is (Oledzka-Slotwinska és Desmet, 1969). Ez utóbbi nyilvánvaló tévedés, mivel a kettős IM vékony, a plazmamembrán pedig vastag típusú membrán. A RER-ből, illetve más preformált membránból transzformációval való keletkezés legerősebb támasza az a dogma volt, amely szerint a sejtekben membrán kizárólag membránból keletkezik.
A továbblépéshez fontos volt az autofagoszóma membrán sajátosságainak felderítése, és az autofagoszóma fázis előtti formák, tehát a még nem záródott IM-ok, azaz a fagofórok megfigyelése. Az autofág izoláló membrán specifikus sajátosságát mutatta az a megfigyelés, hogy megfelelő technikai feltételek mellett a membránja ozmiummal erősebben festődő volt (un. ozmium impregnáció), mint a többi membrán (Arstila és mtsai., 1972; Pfeifer, 1972c).
Mivel az ozmium igen erősen festi a lipideket, ebből azt a következtetés vonták le a szerzők, hogy az IM-nak különösen nagy a lipid tartalma. További kísérleti bizonyítékot jelentett erre Réz Gábor és Jacopo Meldolesi freeze-fracture technikával kapott eredménye (Réz és Meldolesi, 1980). Eszerint az autofagoszóma membránja, szemben pl. az RER membránnal, alig tartalmaz intramembrán partikulákat (vagyis integráns membrán proteineket), tehát szinte tisztán foszfolipidekből áll (1.45-1.46. ábra).
1.45. ábra Sejtmag körüli nyitott izoláló membrán (fagofór) rutinfixálás után, benne az üresnek látszó rés (egér ondóhólyag hámsejt
1.46. ábra A sejtmag körüli fagofór fagyasztva töréses képe. Jól látszik, hogy a fagofór lényegében partikulamentes, tehát nincsenek benne integrális membrán proteinek (egér ondóhólyag hámsejt)
Ezen eredmények szerint tehát az izoláló membrán integráns fehérjéket nem tartalmazó különleges képződmény.
Továbbra is nyitott kérdés marad azonban, hogy hogyan keletkezik? Ulrich Pfeifer elképzelése az volt, hogy citoszólikus lipidekből de novo, tehát újonnan áll össze. A de novo membrán keletkezés szembe ment a „membrán csak membránból jön létre” dogmájával. Az átmeneti preautofagoszómális formák megfigyelésének legnagyobb problémája az volt, hogy ilyenek rendkívül ritkán találhatók. Az első (Locke és Collins, 1965) és a második (Pfeifer, 1971b) még nem zárt izoláló membránról készült kép megjelenése között hat év telt el.
Seglen 1985-ben spekulatív módon arra a hipotetikus következtetésre jutott, hogy az IM egy önálló organellum amely reciklizál (Seglen, 1987). El is nevezte ezt a hipotetikus organellumot fagofórnak. Bár a reciklizációs hipotézis nem bizonyult helyesnek, a fagofór kifejezést ma is használjuk a még nem záródott IM szinonimájaként.
A fagofór fázis részletes morfológiai analízisére csak évtizedekkel később kerülhetett sor, amikor ondóhólyag hámsejtekbenin vitroolyan körülményeket találtunk amelyek mellett sok és igen nagy fagofór keletkezett (Kovács és mtsai., 2007; Kovács és mtsai., 2000) és emellett elsőként megfigyeltük a sejtmag szekvesztrációját (1.47-1.48.
ábra), autofág megemésztését valamint a fagofór fázis reverzibilis voltát.
1.47. ábra Morfológiailag ép szekvesztrált sejtmag autofagoszómában (egér ondóhólyag hámsejt)
1.48. ábra Részlegesen degradálódott sejtmag autolizoszómában (egér ondóhólyag hámsejt)
A vizsgálatokhoz a konvencionális elektronmikroszkópia mellett különböző impregnációs eljárásokat, valamint fagyasztva rögzítéses (kriofixációs) és freeze-fracture technikát is alkalmaztunk. Röviden összefoglalva a következő fő megfigyelések születtek.
1. A fagofór gyakran jelenik meg két RER ciszterna közötti tér közepén, ahol a standard távolságban lévő szomszédos ciszternák közötti teret pontosan felezi, és két oldalán csupán egy sor riboszóma marad közte és az RER membrán között (1.49-1.52. ábra).
2. Sehol nem látható folytonosság a fagofór és az RER membránja között.
3. Nem találhatók elektronmikroszkóppal kimutatható membránnal határolt prekurzor vezikulák a növekvő fagofór közvetlen szomszédságában.
4. A fagofór freeze-fracture technikával vizsgálva az autofagoszóma membránjához hasonlóan intramembrán partikulumoktól mentes (1.45. ábra).
5. A fagofór általában ciszternaszerű megjelenést mutat egyszerű aldehid rögzítés után, mivel belsejében jól látható tágult üres rés van. Hasonló helyzet áll fenn az autofagoszóma IM-ja esetében (1.12-1.13, 1.43-1.44, 1.50 ábra).
Ez annyira jellegzetes, hogy felhasználható az IM és az autofagoszóma azonosítására.
6. Imidazollal (1.48. ábra), csersavval (1.53. ábra) való impregnálás, vagy kriofixálás után (1.50. ábra) nem, vagy csak ritkán és helyenként jelenik meg az üres rés, ehelyett kompakt pentalamináris struktúrát mutat az IM (1.53-1.56. ábra), tehát a fagofór valójában nem ciszterna. Előfordulnak egymáshoz szorosan illeszkedő fagofórok ami azt bizonyítja, hogy membránjuk a planáris régióban nem képes a fúzióra (1.57. ábra).
7. A növekvő fagofórok a környező RER ciszternák lefutását követik, esetenként hosszan kanyarognak az RER ciszternák között és szemmel láthatóan nem záródnak. Ezt a sejtmagok körüli fagogórok és a sejtmagok szekvesztrációja is alátámasztja (1.47-1.48. ábra). Az ilyen fagofórok 7 percen belül eltűnnek a sejtből, a fagofór növekedése tehát reverzibilis. A sejtmagok szekvesztrációját és autofág emésztését, valamint a fagofór növekedésének reverzibilis voltát elsőként mutattuk ki (Kovács és mtsai., 2007; Kovács és mtsai., 2000).
8. A részletes elemzés azt támasztja alá, hogy a fagofór az éles szögben visszahajló széleken nő, ahol a membrán térbeli okok miatt lazább szerkezetű.
1.49. ábra Imidazollal való impregnálás után az izoláló membrán két lemeze szorosan tapad egymáshoz (nyíl) (egér ondóhólyag hámsejt).
1.50. ábra Kriofixálás után az izoláló membrán két lemeze együtt marad. A képe jobb felső oldalán egy lizoszóma a fúzió után beltartalmát az autofagoszóma két membránja közé bocsátja (egér ondóhólyag hámsejt).
1.52. ábra Fagofór és izoláló membrán egér ondóhólyag hámsejt RER régiójában
1.53. ábra Fagofór két RER ciszterna között csersavas rögzítővel fixált egér ondóhólyag hámsejtben. A fagofór egy részében látszik a fehéren feltűnő rés, nagyobbik részén azonban szorosan összetapadnak a kettős membrán lemezei.
1.54. ábra Imidazollal kiegészített rögzítő alkalmazása esetén a fagofór két membránja szorosan összetapad (egér ondóhólyag hámsejt)
1.55. ábra Csersavval kiegészített rögzítő alkalmazása esetén szintén szorosan összetapad a fagofór két membránja (egér ondóhólyag hámsejt)
1.56. ábra Kriofixálással rögzített egér ondóhólyag hámsejtben a fagorórok két membránja szorosan összetapad és világosan megjelenő pentalamináris szerkezetet alkot, nyoma sincs a két membrán közötti résnek
1.57. ábra Csersavval kiegészített rögzítő használata esetén az egér ondóhólyag hámsejtben a fagofórok két membránja között többnyire nincsen rés. A kinagyított képen látható, hogy több fagofór membrán is nőhet egymáshoz szorosan illeszkedve, anélkül, hogy összeolvadnának.
A fentiek alapján megfogalmazható volt egy hipotézis, amely prediktálja a fagofór keletkezésének bizonyos részleteit is. Eszerint a fagofór de novo keletkezik, a membrán prekurzora elektronmikroszkóppal nem mutatható ki. Feltételezhetjük tehát valamilyen labilis és nagy kapacitású új típusú lipidszállító vezikula-rendszer (esetleg micelláris rendszer) létét ami a növekedő fagofórt alkotó membrán lipideket szolgáltatja (Kovács és mtsai., 2007).
A fagofór keletkezésének a fenti gondolatmenet alapján feltételezett folyamatát ábrázolják az 1.58-1.60. ábrák.
Különösen élesztőben egyre több adat támasztja alá, hogy létezhet ilyen szállító mechanizmus amelynek része lehet az egyetlen transzmembrán ATG fehérje, az ATG9 (Yamamoto és mtsai., 2012). A fagofór növekedésének reverzibilis szakasza a gömbbé záródással ér véget.
Az 1.58-1.60. ábrák a fagofór két RER ciszterna keletkezésének egy lehetséges változatát mutatják az ondóhólyag hámsejtek elektronmikroszkópos képeinek elemzése alapján (a rajz elemeinek magyarázatát ld. az 1.60. ábrán).
1.58. ábra Az első lépés a feltételezett, és a szokásos elektronmikroszkópos fixálók használata után ki nem mutatható foszfolipid szállító elemek csoportosulása.
1.59. ábra A második lépés a szokásos elektronmikroszkópos fixálókkal rögzíthető rövid fagofór membrán szakasz megjelenése, amely a szélén nő a beépülő membrán lipidek révén
1.60. ábra A harmadik lépésben a RER ciszterna a záródás előkészítésére meghajlik, miközben a növekvő fagofór követi a görbületet.
A különböző kísérleti rendszerekben kapott részben ellentmondásos adatok arra ösztönöznek sok kutatót, hogy többféle mechanizmust feltételezzenek a fagofór keletkezésére. Továbbra is előfordul, hogy az elektronmikroszkópos képeken ritkán található fagofór-ER membrán kontaktusokat az ER membránból való származás bizonyítékának
tekintik (Hayashi-Nishino és mtsai., 2009; Yla-Anttila és mtsai., 2009), ezek azonban nagy valószínűséggel műtermékek.
A vita sokszor abból adódik, hogy magát a problémát nem pontosan fogalmazzák meg. Mivel a szekvesztrációs membrán csaknem kizárólag lipidekből áll, a kérdés valójában az, hogy honnan származik a fagofór membránjának foszfolipidje és, hogy a membrán lipidek hogyan szerveződnek meg egy új típusú membránná. Biokémiai adatok bizonyítják, hogy a membránokat alkotó foszfolipidek csak az RER-ben, a mitochondriumokban és a Golgi készülékben szintetizálódnak (Blom és mtsai., 2011; Vance és Vance, 2004). Az RER-ből a kanonikus vezikuláris transzporttal (ER, Golgi, lizoszóma, szekréciós vakuóla, plazma membrán) jutnak a különböző membránnal határolt kompartmentumokba. A mitochondrium ebből a szempontból különálló kompartmentumnak látszik. Ha valóban létezik egy nagy kapacitású lipid szállító rendszer, akkor potenciálisan az összes intracelluláris membrán és a plazmamembrán egyaránt lehet a fagofór foszfolipidjeinek forrása.
Az autofágia az eukarióta sejtek legősibb fajaiban pl. az élesztő sejtekben is fontos szerepet játszik és szinte minden sejttípusban előfordul. Ez arra mutat, hogy lényegi kapcsolatban van az eukarióta létezéssel, az eukarióták evolúciójával. Lehetséges tehát, hogy a fagofór keletkezésének tanulmányozása hozzásegít a membránok keletkezése evolúciós folyamatainak tisztázásához is.
Az autofágia klasszikus módszereivel a kapott legfontosabb ismeretek leírása ezzel befejeződik. Az autofágia kutatásának módszerei az 1990-es évek elejétől alapvetően megváltoztak azt követően, hogy a folyamatot felfedezték Saccharomyces cerevisiae-ben. Ennek köszönhetően lehetővé vált az autofágia kutatása a legkorszerűbb molekuláris genetikai módszerekkel. Ez a folyamat iránti óriási érdeklődéshez, a benne résztvevők számának soha nem látott növekedéséhez vezetett. 2004-ben megszületett az első csak autofágiával foglakozó könyv (Klionsky, 2004) és megindult a kizárólag autofágiával foglalkozó konferenciák, szimpoziumok szervezése. Korábban az autofágia kutatás eredményei a fehérjelebontással foglalkozó könyvek és szimpoziumok részei voltak. 2005-benDaniel J.
Klionsky(függelék 19. ábra) kezdeményezésére megindult az Autophagy című folyóirat. Az autofágia iránti érdeklődés óriási fellendülését mutatja az is, hogy míg 1957-1992-ig csak 2 míg 1992-2007 között 30 olyan cikk jelent meg a Science vagy a Nature folyóiratban amely autofágiával foglalkozott.