Az autofágia molekuláris mechanizmusa, az abban szereplő gének és géntermékek mibenléte egészen az 1990-es évek közepéig-végéig ismeretlen maradt. Ebből is adódott hogy eddig az időszakig szinte csak leíró jellegű kutatások folytak, azaz megfigyelték hogy milyen körülmények vagy hormonális ingerek váltanak ki autofág választ különféle
élőlények sejtjeiben, de a folyamat fiziológiás vagy patológiás jelentőségét csak korlátozottan lehetett vizsgálni.
Ekkorra már leírtak ugyan olyan hatóanyagokat, amelyekkel az autofág lebontást serkenteni (pl. rapamicin) vagy gátolni (pl. 3-metiladenin vagy klorokvin) lehetett, azonban ezen drogok egyéb intracelluláris folyamatokat is befolyásolnak, így szelektivitásuk kérdéses.
Az igazi áttörést, sok más kutatási területhez hasonlóan, az élesztő genetikai vizsgálatok érték el. Az autofágiát Saccharomyces cerevisiae-ben 1992-ben írták le (Takeshige és mtsai, 1992). Vakuóláris proteináz A és B vagy karboxipeptidáz Y (CPY) hiányos mutáns élesztő sejteket tanulmányoztak, melyek nem képesek a normális lebontásra. Azt tapasztalták, hogy ha a vegetatív körülmények között tartott, minden igényt kielégítően táplált mutáns sejteket nitrogénhiányos, táplálékszegény médiumba teszik át (tehát éhezésre kényszerítik), akkor a fénymikroszkóppal üresnek látszó vakuólumban (ami valójában egy óriási lizoszóma) apró szemcsék jelennek meg (7.10. ábra).
7.10. ábra Élesztősejtek DIC optikával készült fénymikroszkópos képe. A (b) panelen látható, vakuoláris proteázokat gátló PMSF jelenlétében éheztetett élesztő sejt vakuólumában rengeteg apró rögöcske, autofág test figyelhető meg. Az (a) panel autofág gén mutáns élesztő sejtjeiben autofagoszómák, így autofág testek sem jönnek létre éhezés hatására. Forrás: Mol. Biol. Cell 2005: 16 (5), 2544-2553
Elektromikroszkóppal vizsgálva ezeket a sejteket kiderült, hogy a vakuólum belsejében lévő szemcsék citoplazma részeket tartalmazó szimpla membránnal határolt vezikulák, melyeket autofág testeknek nevezték el (7.11. ábra).
7.11. ábra Éheztetett élesztősejtek elektronmikroszkópos képe.A felső sorban látható, éheztett pep4 (vakuoláris hidroláz) mutáns élesztő sejtekben a nagyméretű vakuólum belsejében membránnal határolt citoplazma részletek, autofág testek találhatóak. Ha az Atg1 gén is hiányzik, akkor az autofagoszómák és autofág testek képződése gátolt, üresnek látszik a vakuólum az alsó sorban található képeken. Forrás: Mol. Biol. Cell 2008: 19(2), 668-681 Ezek a citoplazmában keletkeznek mint kettős membránnal burkolt autofagoszómák, majd a külső membránjuk a vakuólum membránnal fúzionál, és a belső membránnal határolt apró, fél-egy mikrométer átmérőjű vezikulák a náluk egy nagyságrenddel nagyobb vakuólum belsejébe jutva megfelelő, differenciális interferencia kontraszt (DIC) képalkotásra képes fénymikroszkópban láthatók. Ennek persze feltétele hogy az autofág testek ne bomoljanak
Autofágia
le szinte azonnal, amit megfelelő vakuoláris proteáz gátlószer kezeléssel (ilyen például a proteináz B-t gátló PMSF, fenil-metil-szulfonil fluorid) vagy a fent említett lebontó enzimek mutánsait vizsgálva lehet elérni. Megjegyzendő hogy ilyen autofág testek az állati sejtekben is keletkeznek, azonban mivel az élesztő és növényi sejtekre jellemző egy nagy vakuólum helyett rengeteg kisebb méretű lizoszómát hordoznak, így azokat gyakorlatilag csak elektronmikroszkóppal lehet kimutatni (7.12. ábra).
7.12. ábra Autofág test morfológiája állati sejtekben.A képen látható sötét autolizoszóma bal oldali részében kitűnően felismerhető egy autofág test (AB, autophagic body). A közvetlenül a kémiai rögzítést megelőzően megtörtént autofagoszóma-lizoszóma fúzió során az autofagoszóma belső membránnal körbevett beltartalma még degradáció jeleit nem mutatja, morfológiája hasonló a környező citoplazmáéhoz. Juhász Gábor felvétele.
Ekkor vált lehetővé, hogy mutagenezis révén autofágiához szükséges géneket izoláljanak. Az autofágiát élesztőben leíró Yoshinori Ohsumi japán kutatócsoportja 1993-ban publikálták az első nagyléptékű genetikai szűrés (screen) eredményeit (Tsukada és Ohsumi, 1993). Proteináz A deficiens (pep4) genetikai háttérben olyan törzseket kerestek amelyek éheztetés hatására nem halmoztak fel autofág testeket. Ezzel a módszerrel azonban csak egy mutánst (APG1) sikerült találni. Ennek vizsgálata során kiderült, hogy ebben a mutánsban nitrogén-éheztetés körülményei között nem fokozódott az endogén fehérjelebontás, és túlélőképessége a vad típusúénál lényegesen rosszabb volt:
néhány napi éhezés hatására a vad típusú sejtekkel ellentétben az APG1 mutáns sejtek többsége elpusztult. Ezt az életképesség csökkentést felhasználva egy újabb kísérlet során 100 000 kémiai mutagenezissel létrehozott törzsből izoláltak 75 APG mutánst. Ezekről kiderítették, hogy 15 komplementációs csoporthoz tartoznak, azaz 15 gént reprezentálnak. A 15 mutáns törzs (APG1-15) mindegyike a következő közös fenotipikus tulajdonságokat mutatta.
1. Nitrogén, szén és aminosav éheztetés körülményei között nem halmozott fel autofág testeket, és életképességét viszonylag gyorsan elvesztette.
2. Nem történt meg benne az endogén proteolízis éheztetés általi erőteljes fokozódása.
3. Egyik homozigóta APG mutáns sem volt képes normális spóraképzésre.
Egy másik, német kutatócsoport által alkalmazott szelekciós rendszerben első markerként egy, a vad típusú élesztősejtekben éheztetés körülményei között lebomló citoszolikus enzimnek (zsírsav szintetáznak) a vakuólában való felhalmozódását detektálták immunológiai módszerrel. Azokat a törzseket amelyekben az autofágiát stimuláló (éhezési) körülmények közt nem tapasztaltak nagy mértékű zsírsav szintetáz szintcsökkenést, tehát feltehetően hiányzott az autofág lebontó aktivitás, PMSF gátlás mellett megvizsgálták arra nézve, hogy képesek-e autofág testeket felhalmozni. Ezen módszerek felhasználásával izolálták az AUT1-9 mutánsokat (Thumm és mtsai, 1994).
Az élesztőben folyó vizsgálatok harmadik vonulata egy szokatlan és teljesen új folyamat felfedezéséhez vezetett.
Daniel J. Klionsky amerikai munkacsoportjának vizsgálatai kiderítették, hogy egy rezidens vakuóláris enzim, az aminopeptidáz I (API), amely a szintézisének befejezésekor a citoszólba jut, egy új és sajátos úton kerül a végleges műlködési helyét jelentő vakuólumba (Harding és mtsai, 1995). Ez lényegesen különbözik a hagyományos úgynevezett ALP (alkalinephosphatase) útvonaltól (7.13. ábra).
7.13. ábra Az ALP (alkaline phosphatase) útvonal.A durva felszínű endoplazmatikus retikulumból (RER) a Golgi-készüléken és Golgi vezikulum úton kerül az enzim a vakuólumba. Kárpáti Manuéla ábrája.
Ennek során az ALP enzim a klasszikus RER – Golgi - Golgi-vezikula utat járja be, végül fúzió révén a vakuólumba kerül. Egy másik jól jellemzett transzport rendszer az RER - Golgi- Golgi-vezikula – endoszóma - vakuólum utat használja. Ezt egy tipikus képviselőjéről (carboxypetidaseY) CPY útvonalnak hívják (7.14. ábra).
7.14. ábra A CPY (carboxypetidase Y) útvonal.A durva endoplazmatikus retikulumból (RER) a Golgi-készüléken keresztül létrejövő vezikulum szállítja az enzimeket, amely előbb endoszómával, majd ezt követően a vakuólummal fúzionál. Kárpáti Manuéla ábrája.
Az API-t szállító mechanizmus újdonságát az adta, hogy ez az enzim kikerüli a fenti útvonalakat és a citoplazmából közvetlenül a vakuólumba kerül. Éppen amiatt ezt a vadonatúj mechanizmust Cvt (cytoplasm tovacuoletargeting) útvonalnak nevezték el. Miután genetikai screen-ekben CVT mutánsokat izoláltak, váratlan módon kiderült, hogy a Cvt út genetikailag, mechanizmusát és elektronmikroszkópos megjelenését tekintve is hasonlóságokat mutat az autofágiával (7.15. ábra).
7.15. ábra A Cvt (cytoplasm to vacuole targeting) útvonal.Az enzim a citoplazmából egyenesen a vakuólumba kerül egy kettős membrán borítású Cvt vezikulumban. Kárpáti Manuéla ábrája.
Például a Cvt mechanizmus elektronmikroszkópban vizsgálva is hasonlít az autofágiához. Mindkettő esetében kettős membrán által végrehajtott szekvesztráció révén, a citoplazma egy része (autofágia) vagy a vakuólumba szállítandó enzimek (Cvt út) elhatárolódnak a citoplazma többi részétől. Az így létrejött Cvt vezikula kisebb méretű (átmérője kb. 150 nm), és ami különösen érdekes, szelekív módon csak a szállítandó enzimeket valamint a csomagolásukhoz szükséges fehérjéket veszi fel. Az autofagoszóma nagyobb méretű, élesztőben átmérője kb. 300-900 nm. Benne a feltételezések szerint többé-kevésbé válogatás nélkül szekvesztrált citoplazma részletek vannak.
Autofágia
A Cvt vezikula vagy az autofagoszóma külső membránja azután a vakuólum membránjával való fúzió révén juttatja a belső membránnal eleinte még továbbra is beburkolt tartalmát, a Cvt vagy autofág testet a vakuólum belsejébe.
Érdekes módon normális tápanyagellátottság esetén a bioszintetikus Cvt útvonal aktív, míg éhezés hatására az élesztősejtek képesek átkapcsolni az autofág útvonalra (7.16. ábra).
7.16. ábra A Cvt (cytoplasm to vacuole targeting) és autofág útvonalak.Az API (aminopeptidáz 1) enzim jól táplált élesztősejtekben a citoplazmából egy kettős membrán borítású Cvt vezikulum közvetítésével kerül a vakuólumba. Éhezés esetén viszont a Cvt útvonal gátlódik, helyette autofág úton jut a vakuólumba ez a hidroláz.
Forrás: Mol. Biol. Cell 2000: 11 (3), 969-982.
Fontos, hogy a Cvt úton szállított enzimek ilyenkor autofágia révén jutnak el a vakuólumba, azaz egy Cvt-specifikus mutáció okozta API transzport hiba „megmenekíthető” éheztetéssel. Megjegyzendő, hogy a Cvt-hez hasonló útvonalat még semmilyen egyéb élesztőfajban vagy magasabb rendű sejtben nem találtak.
Az élesztő autofág mutánsainak felfedezése kétfelé is utat nyitott. Az egyik úton felderíthető az autofágia molekuláris mechanizmusa és szabályozása élesztőben és magasabb rendűekben. A másik úton reverz genetikai módszerekre alapozva meg lehetett célozni az autofágia más modellszervezetekben, köztük állatokban és tenyésztett egér vagy emberi sejteken történő vizsgálatát.
A gyorsabb előrehaladás az autofágia molekuláris hátterének megértésében természetesen az élesztő sejteken valósult meg. Az APG, AUT és CVT mutánsok száma tovább bővült, valamint egyéb mutagenezis screenekből (mint pl. az igen sokféle vezikulatranszport útvonalben szereplő vakuoláris protein sorting, VPS mutánsok) is számos autofágiához szükséges gént izoláltak. Kiderült, hogy a különféle élesztő screenekben azonosított APG/AUT/CVT stb. mutánsok részben allélikusak egymással, tehát ugyanazt a gént érintik. A párhuzamos elnevezések egyre nehézkesebbé tették a folyamatok áttekintését. A helyzet az új évezred elejére megérett a tisztázásra, aminek az eredményeképpen az élesztőben azonosított autofág gének új nevezéktanát vezették be (Klionsky és mtsai, 2003). Az új név az “autophagy-related” kifejezésből az ATG génekre, illetve az Atg fehérjékre vonatkozik élesztőben, de gyakran magasabb rendűekben is hasonló elnevezéssel találkozunk.