ÖRDÖG Dorottya1 - JÁKÓI Zoltán1 - LEMMER Balázs2 - HODÚR Cecília1
1Szegedi Tudományegyetem Folyamatmérnöki Intézet, 6725 Szeged Moszkvai krt. 5-7., hodur@mk.u-szeged.hu
2Szegedi Tudományegyetem Környezettudományi és Műszaki Intézet, 6726 Szeged, Közép fasor 52.
Bevezetés
Kutatásunk célja a mezőgazdasági hulladékokból származó lignocellulóz-tartalmú biomasszából történő ún. második generációs bioetanol gyártás fermentációs lépésének vizsgálata volt Saccharomyces cerevisiae fajélesztő felhasználásával. Különböző cellulóztartalmú anyagok enzimes emésztéséből származó fermentleveket erjesztettünk, majd a keletkezett etanolt desztillációval nyertük ki a közegből. A fermentlevekből kinyert etanol hozamokból meghatároztuk az élesztő biokonverziós hatékonyságát. Ez az érték tájékoztatást nyújtott arról, hogy mely cukorkoncentráció-tartomány volt a legmegfelelőbb az élesztő számára, valamint hogy mely szilárd-alapanyag tartalmú vizes szuszpenzióban képződött magasabb koncentrációjú fermentálható cukor az enzimes hidrolízis során.
Irodalmi áttekintés
A környezeti terhelés csökkentése, valamint a fosszilis energiahordozók készletének végessége következtében a biomassza kezd vonzóvá válni a gazdaság számára, mivel ez számos megújuló anyagból származhat, valamint a bioenergia, illetve bioüzemanyag-termékek előállítása és felhasználása potenciálisan alacsonyabb környezeti hatásokkal jár. A biomassza alapú megújuló energiaforrások előállítása, valamint alkalmazása hazánk adottságait tekintve hosszútávon fenntartható folyamat lenne; energetikai szempontból is kedvező volna, emellett a mezőgazdaság is fejlődhetne általa.
A hagyományos növényi alapú folyékony bio-hajtóanyagok közé tartoznak az olajok, illetve alkoholok, melyek előállításának akadályai közé tartozik egyrészt a nyersanyagok hiánya, mivel ezeket olyan alapanyagokból nyerjük, melyek felhasználása más gazdasági szektorban is jelentős. Erre megoldásul szolgálhat a lignocellulóz-tartalmú biomasszából történő termelésük, mely nagy mennyiségben áll a rendelkezésünkre világszerte. A bioetanol az egyik legígéretesebb alternatíva a fosszilis üzemanyagokkal szemben, egy liter etanol csak 66% energiát biztosít, ugyanekkora mennyiségű benzinnel szemben, azonban a bioetanol oktánszáma - 106-110 -, míg az utóbbié - 91-96 -, mely által a keveréssel nyert tüzelőanyagnak növekszik az oktánszáma, mely lehetővé teszi az égetést magasabb tömörítési arány mellett, rövidebb égési idővel. Az etanol továbbá nagyobb párolgási entalpiával rendelkezik (1177 kJ/kg 60°C-on), mint a benzin (348 kJ/kg 60°C-on). Azáltal, hogy a párolgáshője magasabb az etanolnak (840 kJ/kg), mint a benzinnek (305 kJ/kg) az etanol-keverék volumetrikus hatékonysága is nagyobb, mint a tiszta benzin esetén, ezáltal is javítva a fajlagos energiatartalmát (Zabed et al., 2017).
166
A bioetanol előállítása a lignocellulóz-tartalmú biomassza fermentálható cukrokká való konverziójával kezdődik, majd ezt követi a fermentáció, a desztilláció és végül a dehidratáció.
A szacharifikáció során történik a komplex szénhidrátok lebontása monomerekké. A cellulózrostokat három fő építőegység alkotja; a cellulóz, a hemicellulóz, valamint a lignin.A savas hidrolízissel összehasonlítva, az enzimes hidrolízis kevesebb energiát és enyhébb környezeti viszonyokat igényel, valamint kevésbé környezetterhelő eljárás. Az enzimeknek saját specifitása van, a cellulóz glükóz egységei között lévő β-1,4 kötéseket a celluláz enzimcsalád képes bontani, míg hemicellulóz rész különböző cukor egységeket tartalmaz, ennélfogva ennek a lebontásához több komplexebb enzimre van szükség (Nibedita et al., 2012).
A hidrolízis során keletkező fermentálható cukrok konverziójára a leggyakrabban alkalmazott mikroorganizmusok az élesztők, különösen a Saccharomyces cerevisiae, mivel nagy mennyiségű etanolt tud előállítani, a citoplazma membránja szelektíven permeábilis, magas a stressz tűrő képessége (pH, ozmotikus vagy hőmérsékleti sokk), valamint képes tolerálni a 18%-os alkoholkoncentrációt is. Oxigén és szubsztrát jelenlétében gyorsan nő a sejttömeg, anaerob körülmények között pedig etanolt állít elő (Ramon, Anderson, 2017). A gombák heterotrófok, ezért szerves szénforrásra van szükségük, hogy elő tudják állítani a számukra fontos anyagokat. A cukrok közül a hexózok fermentálására képesek (Alexander, Hiroshi, 2007), azonban a pentóz, vagyis az öt szénatomos cukrokéra nem. A pentózokat csak az élesztők néhány nemzetsége képes alkohollá átalakítani, ilyen a Pichia, a Candida, a Schizosaccharomyces és a Pachysolen (Siti et al. 2017). Az élesztő sejtek optimális működéséhez a fermentáció ideje alatt biztosítani kell az az ideális körülményeket. A Saccharomyces cerevisiae hőmérsékleti optimuma 30˚C, a közeg pH-ja pedig 4,0-5,0 közötti tartományban a legmegfelelőbb a sejtek számára, továbbá a fermentáció időtartama alatt laboratóriumi/ipari körülmények között a keverés biztosítja a sejtek hozzáférését a tápanyagokhoz, valamint a keletkező etanol ezáltal kerül eltávolításra az élesztőtől (Siti et al., 2017).
A Saccharomyces cerevisiae a glükózt specifikus aktív transzport során veszi fel, ezt követően pedig a glikolízis során alakítja át alkohollá, ami valójában az élesztő növekedésének a mellékterméke, és a szubsztrátum egy részét az élesztő a sejtek energiaellátására használja fel. A biokonverzió hatásfoka Gay Lussac (1910) összefüggése alapján határozható meg, mely szerint 180 g glükózból élesztővel történő fermentáció során 92 g etanol és 88 g szén-dioxid keletkezik.
C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 (Siti et al., 2017).
Az erjedés befejeztével szükségessé válik egy desztillációs tisztítási lépés, mivel a fermentáció végtermékeként alkohol, víz, és a fermentáció során keletkezett egyéb melléktermékek keverékét kapjuk. A folyamat alacsony termodinamikai hatékonysága miatt az ipari üzemben az energiafogyasztás nagy részéért felelős, így a desztillációs oszlopok tervezése fontos szerepet játszik a termodinamikai értékelésnél, ahol nemcsak a felhasznált energiát veszik figyelembe, hanem azt is, ahogyan ez az energia a szétválasztás során hasznosul (Rivana et al., 2018). A desztilláció végeztével a visszamaradt fermentlevet szeszmosléknak nevezik, mely már alkoholt nem tartalmaz és
167
a haszonállatok takarmányozására használható fel. A kinyert bioetanolt dehidratálni kell, hogy 1% alá csökkenjen a víztartalma, és benzinnel keverhető legyen (Kiss, 2013).
Anyag és módszer
A kutatásunk során a méréseinkhez modell oldatokat, illetve három különböző fermentlé típust (1. táblázat) használtunk fel. A modell oldataink vízmentes glükóz vizes oldatai voltak, melyeket eltérő cukorkoncentrációkban készítettünk el, hogy a folyamat végén kapott etanol koncentráció értékekből egy kalibrációs görbétkészítsünk.
1. táblázat. A felhasznált valós fermentlé-típusok
Vizes szuszpenzió száraz-alapanyaga Hidrolízishez használt enzim 1. Cobex Feeds 12/30 kukoricacsutka-őrlemény Cellic (Sigma Cellic CTec2) enzimkeverék
2. Cobex Feeds 12/30 kukoricacsutka-őrlemény xilanáz
3. biomassza előállítása céljából termelt
dohánynövény celluláz és cellobiáz
Table 1. The used fermentation broths types
(1)the solid ingridient of the suspension, (2) the used enzyme for the hydrolysis
A hidrolízist követően a fermentlevek egy többlépcsős membránszeparációs eljáráson estek át (mikroszűrés, ultraszűrés, nanoszűrés), majd az így keletkezett mintákban 3,5-dinitro-szalicilsav (DNSA) segítségével határoztuk meg a redukáló cukrok mennyiségét.
A mérést követően az 1 liter fermentlevekhez a közkereskedelemben is kapható borélesztőt adtunk, melyből 0,3 grammot mértünk ki, ezután pedig ezzel megegyező tömegű tápsót mértünk a rendszerbe, mely a sejtek stimulálását és szaporodását biztosította, ennek segítségével azerjedés kiegyensúlyozottan folyt az Infors Minfirors típus fermentorban, ami automata módon szabályozta a körülményeket (hőmérséklet, pH, kevertetés). Szakaszos-, vagyis batch fermentációt alkalmaztunk. Lassú kevertetést (n=1/40 min) állítottunk be, hogy a rendszer homogén legyen az erjesztés során, valamint a Saccharomyces cerevisiae számára az irodalomban feljegyzett értékeket vettük alapul, vagyis 30˚C-os hőmérsékletet, illetve 4,5-ös pH-át, melyethíg kénsavval, valamint híg nátrium-hidroxiddal állított be a gép.Az erjesztés időtartama 5 nap volt. A fermentáció végtermékeként kapott etanolt rotációs desztilláló berendezéssel nyertük ki, majd a desztillátumok alkoholtartalmát egy Atago márkájú refraktométerrelhatároztuk meg.
Eredmények és értékelésük
A vizsgálatainkat először a tiszta glükóz tartalmú vizes oldatokon végeztük el, melyeket különböző cukorkoncentrációban készítettünk el, majd fermentáltunk. Az élesztő sejtek biokonveziós hatásfokát a mért, illetve a Gay-Lussac összefüggése alapján számított elméleti etanol hozam hányadosából határoztuk meg. A kezdeti 5%-os cukorkoncentráció mellett az átalakítás hatásfoka alacsony volt, azonban a glükóz mennyiségének növekedésével az erjedés hatékonysága is növekedett, 10%-tól 20%-ig a hatásfok 0,9 és 0,93 között változott, amely közel volt az élesztő maximális működéséhez. 25% és 30%-os cukorkoncentráció esetén már jelentős csökkenés volt megfigyelhető az élesztő fermentációs hatékonyságában, majd pedig 40%-os cukorkoncentrációnál a várható etanol hozam 19,42% lett volna, azonban ezt az
168
alkoholkoncentrációt az élesztő már nem volt képes tolerálni, alkohol gátlás lépett fel, valamint a magas glükóz szint a sejtekre ható ozmotikus nyomást is növelte. A modell oldatokon elvégzett méréseket követően a valós fermentleveket vizsgáltuk meg.
1.ábra. (1) az etanol koncentrációja és (2) az erjedés hatásfoka a cukorkoncentráció függvényében Figure 1. (1)The concentration of ethanol and (2) the efficiency of the fermentation depending on the sugar concentration
(1)x-axis: sugar concentration [m/V%], y-axis: ethanol concentration [%] (2) x-axis: sugar concentration [m/V%], y-axis: fermentation efficiency [-]
A fermentlevekre jellemző volt, hogy a kezdeti 3% körüli cukorkoncentráció esetén nem keletkezett kinyerhető mennyiségű etanol a közegben, mivel ezt a glükóz mennyiséget a sejtek a saját életfolyamataik energiaszükségletének kielégítésére használták fel. Ezt követően a cukor mennyiségének emelkedésével az etanol mennyisége is folyamatosan növekedett a rendszerben. Ahogy azt az 1. ábra 1. része is mutatja, az etanol koncentrációja a dohánynövényt tartalmazó fermentlében közel lineárisan növekedett, és a kukoricacsutka-őrleményből származó Cellic enzimkeverékkel való emésztés során keletkezett fermentlében is hasonlóan magas volt az etanol hozama. A xilanázos emésztésen átesett Cobex Feeds 12/30-at tartalmazó fermentlénél azonban jóval alacsonyabb etanol hozam volt megfigyelhető. A 1. ábra 2.
része a Saccharomyces cerevisiae biokonverziós hatékonyságát mutatja be az egyes fermentlevek esetén. Megállapítható, hogy a dohánynövényt tartalmazó cellulázzal és cellobiázzal való emésztés során keletkezett fermentlében volt a legmagasabb az erjedés hatásfoka, mert ezek az enzimek az együttmüködésük során az élesztő számára könnyen felhasználható glükóz molekulákat hasítottak le a cellulózból. A Cellic enzimkeverékkel emésztett kukorica-csutka őrleményt tartalmazó fermentlében kissé alacsonyabb volt az élesztő biokonverziós rátája, ugyanis ebben az enzimkeverékben hemicelluláz is található, a celluláz és β-glükozidáz mellett, mely a hemicellulózból olyan öt szénatomos cukrokat is lehasít, melyek a mikroba számára nem felhasználhatóak. Ennek
(1) (2)
169
a két fermentlé-típusnak az eredményei alapján megfigyelhető, hogy az élesztő sejtek működéséhez a 10%-os cukorkoncentráció optimális, ebben az esetben elég glükóz található a rendszerben ahhoz, hogy biztosítsa a sejttömeg növekedéséhez szükséges energiaigényt, emellett etanolt tudjon előállítani, közel maximális hatásfokkal. A xilanáz enzimmel emésztett kukorica-csukta-őrlemény esetén alacsonyabb volt az erjedés hatásfoka, mert a xilanáz enzim xilóz molekulákat hasít le a hemicellulózról, melyet az élesztő nem képes fermentálni. A kis mennyiségben kinyert alkohol annak lehet az eredménye, hogy a lignocellulóz egy poliszacharid, és így az emésztése során olyan cukormolekulák is felszabadulhattak, melyeket az élesztő képes volt konvertálni.
Következtetések
Az elvégzett kísérletekből arra következtethetünk, hogy az élesztő a 10-20%-os cukor-koncentráció tartományban működik legmegfelelőbben; 0,9 körüli hatásfokkal, így nem érdemes ezen érték fölé emelni a cukor mennyiségét a rendszerben.
A Saccharomyces cerevisiae fajélesztővel végzett erjesztés során jelentős, hogy glükóz molekulák legyenek a közegben, mert már alacsony mennyiségű öt szénatomos cukormolekula jelenléte is eltérést okoz az alkoholhozamban. A lignocellulóz a glükózt követően a xilózt tartalmazza legnagyobb mennyiségben, így érdemes más fajokat is alkalmazni az erjesztés során kevert kultúrában. A fermentlevek közül a cellulázzal és cellobiázzal együtt emésztett dohánynövényt tartalmazó fermentlében keletkezhetett a legtöbb glükóz, illetve a legkevesebb gátló melléktermék, ezáltal ebben tudott a Saccharomyces cerevisiae a legmagasabb biokonverziós rátával dolgozni.
Összefoglalás
Magyarországon a megújuló energiaforrások közül a biomassza rendelkezik az egyik legjelentősebb potenciállal. A nagy mennyiségben rendelkezésünkre álló mezőgazdasági hulladékokból származó lignocellulóz-tartalmú biomasszában enzimes emésztést követően fermentálható cukrok keletkeznek, melyeket a vizsgálatunk során alkalmazott Saccharomyces cerevisiae képes etanollá konvertálni. Az így keletkezett alkohol pedig ezt követően desztillációval nyerhető ki a közegből.
A dohánynövény alapú vizes szuszpenzió, mely cellulázzal és cellobiázzal lett emésztve a várható elméleti etanol-koncentráció értékekhez közeli eredményeket hozott, a legmagasabb 9,54%-os cukorkoncentráció mellett 0,97 volt a hatásfoka, vagyis ebben keletkezett a legtöbb az élesztő által fermentálható cukor, mivel ezek az enzimek a mikroba számára könnyen felhasználható glükóz molekulákra bontották a lignocellulóz-tartalmú biomasszát.
A Cobex Feeds 12/30-at tartalmazó Cellic enzimkeverékkel hidrolizált fermentlé esetén az élesztő alacsonyabb hatásfokkal működött. Ez annak volt a következménye, hogy a Cellic enzimkeverék hemicellulázt is tartalmaz, mely a hemicellulóz emésztésekor olyan egységeket is hasít le a poliszacharidról, melyek öt szénatomos szacharidok, és így az élesztő számára felhasználhatatlanok.
A xilanáz enzimmel végzett emésztés során keletkezett kukoricacsutka-őrleményből származó fermentlénél az élesztő hatékonysága alacsony volt, ugyanis annak ellenére, hogy a keletkezett redukáló cukrok mennyisége ebben az esetben is hasonló volt, mint az előző két fermentlé típusnál, ezt a cukrot az élesztő nem tudta fermentálni, mert a
170
xilanáz xilóz molekulákat hasított le a hemicellulózból. Kevés alkohol mégis kinyerhető volt ezekből az erjedésen átesett fermentlevekből is, mivel a cellulóz egy poliszacharid, és az emésztés során kis mennyiségű glükóz molekula is felszabadulhatott belőle.
Kulcsszavak: bioetanol, fermentáció, desztilláció, lignocellulóz Köszönetnyilvánítás
A kutatócsoport köszönetet nyilvánít a Nemzeti Kutatási, Fejlesztési és Innovációs Hivatal – NKFIH, K115691, és Az EFOP-3.6.2-16-2017-00010 azonosító számú
„Fenntartható nyersanyag-gazdálkodás tematikus hálózat fejlesztése – RING 2017 által nyújtott anyagi támogatásért.
AZ EMBERI ERŐFORRÁSOK MINISZTÉRIUMA UNKP-18-3 KÓDSZÁMÚ ÚJ NEMZETI KIVÁLÓSÁG PROGRAMJÁNAK TÁMOGATÁSÁVAL KÉSZÜLT
Irodalom
Alexander N. Glazer, Hiroshi Nikaido: 2007. Microbial biotechnology: Fundamentals of Applied Microbiology, Second Edition, Cambridge University Press, 554p, 463-485
H. Zabed, J. N. Sahuc, A. Suelya, A. N. Boycea, G. Faruqf: 2017. Bioethanol production from renewable sources: Current perspectives and technological progress, Renewable and Sustainable Energy Reviews 71, 475–501
Kiss Csongor Gábor: 2013. Száraz őrléses bioetanol-előállítás legfontosabb lépéseinek részletes elemzése, Agrártudományi Közlemények, 2013/51. 123- 126
Nibedita Sarkar, Sumanta Kumar Ghosh, Satarupa Bannerjee, Kaustav Aikat: 2012. Bioethanol production from agricultural wastes: An overview, Renewable Energy 37, 19-27
Rivana Mabel Lucena Oliveira Souto, Gilvan Wanderley Farias Neto, Fabricia Sales de Araújo, Marcella Feitosa de Figueiredo, Wagner Brandão Ramos, Karoline Dantas Brito, Romildo Pereira Brito: 2018.
Rigorous thermodynamic evaluation of the extractive distillation process, Chemical Engineering Research and Design 133, 195–203
Siti Hajar Mohd Azhar, Rahmath Abdulla, Siti Azmah Jambo, Hartinie Marbawi, Jualang Azlan Gansau, Ainol Azifa Mohd Faik, Kenneth Francis Rodrigues: 2017. Yeasts in sustainable bioethanol production:
A review, Biochemistry and Biophysics Reports 10, 52-61.