7. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS
7.3. Az Fc-receptorok szerepének és jelátvitelének vizsgálata neutrofilekben
Az immunkomplexek általi neutrofil-aktiváció fontos pathogenetikai szerepet játszik számos betegség, köztük az autoimmun vasculitisek, egyes glomerulonephritis-formák és a rheumatoid arthritis patomechanizmusa egyes aspektusainak létrejöttében. Mivel ezen esetekben a neutrofilek aktivációja elsősorban felülethez kötött IgG immunkomplexeken keresztül jön létre, munkacsoportunkban beállítottuk és vizsgáltuk a neutrofilek immobilizált immunkomplexek általi aktivációját.
7.3.1. Neutrofilek aktiválódása immobilizált immunkomplexek által
A neutrofilek immunkomplexek általi aktiválódását a sejtek immobilizált immunkomplex-felszínre helyezésével értük el további szolúbilis stimulus
alkalmazása nélkül (68. ábra). Ezen kísérletek során ELISA-lemezek üregeit először antigén-oldattal, majd (a szabad kötőhelyek blokkolása után) az adott antigén elleni antitest oldatával inkubáltuk. Az így kezelt felszínre helyeztük a neutrofileket, majd vizsgáltuk azok funkcionális válaszkészségét.
Kísérleteink első részében humán neutrofileken vizsgáltuk az immobilizált immunkomplexek által kiváltott sejtválaszokat. Amint az a 69. ábra A részén látható, humán szérumalbumin (HSA) és nyúl poliklonális anti-HSA antitestek által képzett immobilizált immunkomplexek a humán neutrofilek nagymértékű szabadgyök-termelését váltották ki, míg bármelyik komponens elhagyása esetén a válasz nem jött létre. HSA–anti-HSA immunkomplexeken kívül jól mérhető választ kaptunk az ovalbumin (Ova) és anti-Ova, illetve a laktoferrin (Lfr) és anti-Lfr immunkomplexekkel is, míg a nem azonos specificitású antigén-antitest párok nem váltottak ki sejtaktiválódást (69. ábra B része). Az immobilizált immunkomplexek a szuperoxid-termelés mellett a zselatináz-granulumok ürülését és a sejtek szétterülését is kiváltották (49. ábra C-D része).
[1-34]
68. ábra: A neutrofilek aktiválódása immobilizált immunkomplexek által
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele
Annak igazolására, hogy a fenti sejtválaszokat az alkalmazott immunglobulinok Fc része váltja ki, pepszines hasítás révén a
poliklonális anti-HSA antitestből F(ab')2 fragmenseket készítettünk, és ezekkel is megkíséreltük a humán neutrofilek aktiválását. Amint a 70. ábra A részén látható, az anti-HSA antitest F(ab')2 fragmense nem volt képes a neutrofilek aktiválására. Annak ellenőrzésére, hogy a sejtválasz hiánya nem az F(ab')2 fragmensek lekötődésének a zavara miatt jön-e létre, az antitestek Fab és Fc részeire specifikus másodlagos antitestekkel megvizsgáltuk a különböző anti-HSA antitest-preparátumok lekötődését az
immobilizált HSA-hoz. Várakozásainknak megfelelően a nyúl IgG Fc-része ellen termeltetett másodlagos antitest csak a teljes anti-HSA lekötésekor adott jelet, míg a nyúl IgG Fab-részét felismerő másodlagos antitesttel a lekötődött teljes anti-HSA antitestek és anti-HSA F(ab')2 fragmensek egyaránt jelölődtek. Az F(ab')2 fragmenseket tehát sikerült hatékonyan lekötnünk az immobilizált HSA antigénekhez, de az F(ab')2-t tartalmazó immunkomplexek az Fc-rész hiánya miatt nem voltak képesek a neutrofilek aktiválására.
A következőkben összehasonlítottuk a neutrofilek immobilizált immunkomplexek általi aktiválódásának a mértékét a sejtek más módon való aktiválódásával. Amint az a 71. ábrán látható, az immunkomplex-kiváltotta
szabadgyök-termelés mind humán, mind egér neutrofilek esetében meghaladta az egyéb alkalmazott fiziológiás stimulusok, köztük a
citokalazin-B-előkezelés után alkalmazott fMLP, a
fibrinogén-felszínen adott TNF vagy az immobilizált anti-CD18 antitestek által kiváltott sejtválaszokat és megközelítette a sejtek legerősebb
A B C D
69. ábra: Immobilizált IgG immunkomplex (IC) által indukált szabadgyök-termelés (A-B), degranuláció (C) és szétterülés (D) humán neutrofilekben. HSA: humán szérum-albumin; Ova: ovabumin; Lfr: laktoferrin. Publikálva:
[12]
70. ábra: Teljes IgG antitestet és F(ab')2 IgG-t tartalmazó immunkomplexek hatása humán neutrofilek aktiválódására (A) és az antitestek felszíni
lekötődésének ellenőrzése (B). OD: optikai denzitás.
Publikálva: [12].
71. ábra: Immobilizált IgG immunkomplexek (IC) és egyéb sejtaktiválási módok hatásának összehasonlítása humán (A)
és egér (B) neutrofilekben (PMN). CB: citokalazin B; Fbg:
fibrinogén. Publikálva: [12].
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele ismert aktivátorának, a nem-fiziológiás mechanizmusokon keresztül ható PMA-nak a hatását.
7.3.2. Fc-receptorok azonosítása neutrofilek immunkomplex-általi aktivációjában
Bár az immunkomplex-mediált neutrofil aktiváció által kiváltott kórfolyamatokat leggyakrabban kísérleti egereken modellezik, kísérleteink kezdetén egyáltalán nem volt ismert, hogy mely Fc-receptorok vesznek részt az egér neutrofilek immunkomplex-indukált aktiválódásában. Ennek egyik lehetséges magyarázata az volt, hogy az egér neutrofilek felszínén nagy mennyiségben jelen levő FcγRIV fehérjét csak kísérleteink előtt néhány évvel azonosították [130]. A következőkben ezért megpróbáltuk azonosítani az egér neutrofilek immunkomplex-kiváltotta aktiválódásában szerepet játszó Fc-receptorokat.
Amint azt az 72. ábra mutatja, FcRγ–/– neutrofilekben teljesen megszűnt az immunkomplex-indukált szabadgyök-termelés, degranuláció és szétterülés. Ez arra utalt, hogy az immunkomplexek FcRγ-hoz kapcsolódó Fc-receptorokon keresztül aktiválják az egér neutrofileket.
Az egér mieloid sejtek felszínén jelen levő FcRγ-asszociált receptorok közül legismertebbek az FcγRIII és az FcγRI, melyek közül az előbbi nagy mennyiségben van jelen egér neutrofilek felszínén, de az utóbbi is megjelenhet a sejtek aktivációja során [131].
Amint azt az 74. ábra mutatja, önmagában sem az FcγRIII, sem az FcγRI törlése, de még a két receptor együttes hiánya sem okozta a neutrofilek immunkomplex-indukált válaszképességének a jelentős károsodását (bár az FcγRIII hiánya a sejtválaszok enyhe csökkenését hozta létre). Feltételezhető volt tehát, hogy egy további FcRγ-asszociált receptor ilyen körülmények között is képes létrehozni a neutrofilek aktiválódását.
A B C
Vad típus FcRγ–/–
Kontroll IC Kontroll IC
IC
Zselatináz zimogram
Vad típusFcRγ–/–
Kontroll
0 2 4 6 8
0 20 40 60
Idő (perc) Szuperoxid-termelés (nmol/106 sejt)
Vad típus FcRγ–/–
72. ábra: Immobilizált IgG immunkomplexek (IC) által indukált szabadgyök-termelés (A), degranuláció (B) és szétterülés (C) FcRγ–/– neutrofilekben. Publikálva: [12]
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele
A jelen kísérletsorozatot pár évvel megelőzően Nimmerjahn és munkatársai [130]
azonosítottak egy új FcRγ-asszociált Fcγ-receptort, az FcγRIV-et, mely nagy mennyiségben expresszálódott egér neutrofilek felszínén. Bár az FcγRIV autoimmun betegségmodellekben betöltött szerepét többen is vizsgálták, nem volt tiszta, hogy mely sejttípusokon és milyen sejtválaszokban vesz részt a fehérje. A következőkben megvizsgáltuk az FcγRIV blokkolásának a hatását vad típusú és FcγR3–/– neutrofilek immunkomplex-indukált aktiválódásában.
Amint a 74. ábra A részén látható, mind az FcγR3–/– mutáció, mind az FcγRIV blokkolása kismértékben csökkentette a neutrofilek válaszkészségét, de egyik sem okozta az immunkomplex-indukált szabadgyök-termelés jelentős csökkenését. A két beavatkozás kombinációja (tehát az FcγRIV blokkolása FcγR3–/– sejteken) azonban a szuperoxid-termelés teljes gátlását eredményezte. Ezzel összevethető képet mutatott a degranuláció és a szétterülés vizsgálata, melyeket szintén teljes mértékben gátolt az FcγRIII és az FcγRIV együttes inaktiválása (74. ábra B-C része).
A fenti eredményeket ezután megpróbáltuk megismételni oly módon, hogy antitestekkel blokkoltuk az FcγRIII-t és/vagy az FcγRIV-et. Az FcγRIII esetében ehhez az egér FcγRIII-t és a gátló hatású FcγRIIB-t együttesen gátló FcγRII/III-blokkoló antitesteket alkalmaztunk. Amint az a 75. ábrán látható, a két blokkoló antitest együttes alkalmazása
Kontroll IC Kontroll IC Kontroll IC Kontroll IC
B
FcγR3–/–
+ Izot. kontr.
Vad típus
+ anti-FcγRIV FcγR3–/–
+ anti-FcγRIV Vad típus
+ Izot. kontr.
FcγR3–/–
+ Izot. kontr.
Vad típus + anti-FcγRIV
FcγR3–/–
+ anti-FcγRIV
Zselatináz zimogram
A
KontrollIC
Vad típus + Izot. kontr.
C
0 2 4 6
0 20 40 60
Idő (perc) Szuperoxid-termelés (nmol/106 sejt)
Vad típus + Izot. kontr.
FcγR3–/– + Izot. kontr.
Vad típus + anti-FcγRIV FcγR3–/– + anti-FcγRIV
74. ábra: Immobilizált IgG immunkomplex (IC) által indukált szabadgyök-termelés (A), degranuláció (B) és szétterülés (C) FcγRIV-blokkoló és izotípus kontroll (izot. kontr.) antitesttel kezelt vad típusú és FcγR3–/–
neutrofilekben. Publikálva: [12]
B Vad típus FcγR3–/– FcγR1–/– FcγR1–/–FcγR3–/–
Kontroll IC Kontroll IC Kontroll IC Kontroll IC
C FcγR1–/–FcγR3–/–
Zselatináz zimogram
A
KontrollIC
Vad típus FcγR3–/– FcγR1–/–
0 1 2 3 4 5
0 20 40 60
Idő (perc) Szuperoxid-termelés (nmol/106 sejt)
Vad típus FcγR3–/–
FcγR1–/–
FcγR1–/–FcγR3–/–
73. ábra: Immobilizált IgG immunkomplex (IC) által indukált szabadgyök-termelés (A), degranuláció (B) és szétterülés (C) FcγRI és/vagy FcγRIII genetikai hiányában egér neutrofilekben. Publikálva: [12]
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele lényegében megszüntette a neutrofilek szabadgyök-termelését, degranulációját és szétterülését, míg külön-külön egyik antitestnek sem volt jelentős hatása.
Fenti kísérleteinket összefoglalva elmondhatjuk, hogy egér neutrofilek immobilizált immunkomplexek általi aktiválódásában elengedhetetlen szerepe van az FcγRIII és FcγRIV fehérjéknek, de a két fehérje jelentősen átfedő funkcióval rendelkezik és nagyrészt képesek a másik hiányának vagy inaktiválásának a hatását kompenzálni.
További, itt nem bemutatott kísérleteinkben megvizsgáltuk humán neutrofilek hasonló körülmények között létrejövő aktiválódásának a mechanizmusát, különösen mivel a humán neutrofilek az egér neutrofilektől jelentősen eltérő Fc-receptorokat expresszálnak (nincs rajtuk jelen FcγRIV, de expresszálnak két speciális másik Fcγ-receptort, a receptor ligand-kötő láncában ITAM-et hordozó FcγRIIA-t és a GPI-horgonnyal a plazmamembránhoz kötődő FcγRIIIB-t). Blokkoló antitestek alkalmazásával az irodalmi adatokkal egybecsengően azt találtuk, hogy a humán neutrofilek immunkomplexek általi aktiválódásához az FcγRIIA és az FcγRIIIB egyaránt szükséges (tehát az egyik blokkolása esetén a másik lényegében nem képes a funkcionális kompenzációra) [12].
7.3.3. A PLCγ2 szerepe neutrofilek immunkomplex-indukált aktivációjában A következő kísérletekben a PLCγ2
aktiválódását és esetleges szerepét vizsgáltuk neutrofilek immunkomplex-indukált aktiválódása során. Amint az a 76. ábrán látható, az immunkomplex-felszínre helyezett neutrofilekben a PLCγ2 foszforilációja volt megfigyelhető, és ehhez a foszforilációhoz szükséges volt az Src-kinázok (Hck, Fgr és Lyn), illetve a Syk jelenléte.
További nem-publikált eredményeink szerint a neutrofilek intracelluláris Ca2+-raktárainak a depletálása az immunkomplex-kiváltotta sejtválaszok megszűnését eredményezte.
Mindezek a Ca2+-szignált létrehozni képes PLCγ2 lehetséges szerepére utaltak.
Kontroll IC Kontroll IC Kontroll IC Kontroll IC anti-FcγRII/III
75. ábra: Immobilizált IgG immunkomplex (IC) által indukált szabadgyök-termelés (A), degranuláció (B) és szétterülés (C) FcγRII/II-blokkoló és/vagy FcγRIV-blokkoló, illetve izotípus kontroll (izot. kontr.) antitesttel kezelt
vad típusú egér neutrofilekben. Publikálva: [12]
A
kDa
B
kDa
Vad típus Syk–/–
Ko ntroll IC Kontroll IC
Vad típus Src-család KO
Ko ntroll IC Kontroll IC
PLCγ2 által közvetített foszforilációja immunkomplex (IC) felszínre helyezett neutrofilekben Src-család
KO: Hck–/–Fgr–/–Lyn–/–. Publikálva: [13]
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele Ezután megvizsgáltuk, hogy hogyan változnak az immunkomplex-kiváltotta sejtválaszok PLCγ2–/– neutrofilekben. Amint az a 77. ábra A részén látható, a PLCγ2 hiánya lényegében megszüntette a neutrofilek immunkomplex-felszínen kialakuló szuperoxid-termelését. Hasonló gátlás volt megfigyelhető a zselatináz-granulumok ürülése és a sejtek szétterülése esetén is. A PLCγ2 tehát fontos funkcionális szerepet tölt be a neutrofilek Fc-receptorokon keresztüli aktiválódásában.
7.3.4. A p190RhoGAP vizsgálata az immunkomplex-indukált sejtaktivációban Utoljára megvizsgáltuk, hogy szerepet játszik-e a
p190RhoGAP a neutrofilek immunkomplex-kiváltotta sejtválaszaiban. Amint azt a 78. ábra mutatja, az immunkomplex-felszínre helyezett p190RhoGAP–/–
neutrofilek a vad típusú sejtekhez hasonló mértékben termeltek szuperoxid szabadgyököt. A p190RhoGAP teát feltételezhetően nem játszik elengedhetetlen szerepet a neutrofilek Fc-receptorokon keresztüli aktiválódásában.
7.3.5. Megbeszélés
Ebben a fejezetben az egér neutrofilek immobilizált
IgG immunkomplexeken keresztüli aktiválódásának mechanizmusát vizsgáltuk. Kísérleteink során kimutattuk, hogy az immunkomplexek által kiváltott sejtválaszokhoz elengedhetetlen két FcRγ-asszociált aktiváló hatású Fcγ-receptor, az FcγRIII és az FcγRIV (72. és 74-75.
ábra) [12]. Ezen kísérleteinkben elsőként sikerült egy IgG-függő celluláris hatást rendelnünk az újonnan leírt FcγRIV-hez. További kísérleteinkben igazoltuk, hogy az ilymódon kiváltott sejtválaszok a PLCγ2 közreműködésével jönnek létre (77. ábra) [13]. Egyelőre nem publikált előzetes eredményeink szerint az immunkomplex-indukált sejtválaszokhoz szükségesek az Src-kinázok (Hck, Fgr és Lyn) és a Syk is. Összességében tehát elmondhatjuk, hogy az egér neutrofilek immunkomplex-indukált aktivációja során feltételezhetően fontos szerepet játszik az FcγRIII és FcγRIV receptorokból kiinduló Src-család–FcRγ–Syk–PLCγ2 jelpálya.
A B C
Vad típus PLCγ2–/–
Kontroll IC Kontroll IC
IC
Zselatináz zimogram
Vad típusPLCγ2–/–
Kontroll
0 1 2 3 4 5 6
0 20 40 60
Idő (perc) Szuperoxid-termelés (nmol/106 sejt)
Vad típus PLCγ2–/–
77. ábra: Immobilizált IgG immunkomplex (IC) által indukált szabadgyök-termelés (A), degranuláció (B) és szétterülés (C) PLCγ2–/– neutrofilekben. Publikálva: [13].
0 1 2 3 4 5 6
0 20 40 60
Idő (perc) Szuperoxid-termelés (nmol/106 sejt)
Vad típus p190RhoGAP–/–
78. ábra: Immobilizált IgG immunkomplexek által kiváltott szuperoxid-termelés p190RhoGAP–/–
neutrofilekben. Publikálva: [14].
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele