A p190RhoGAP-hiányos egerek létrehozása és általános jellemzése

Korábbi irodalmi adatok a p190RhoGAP fehérje esetleges szerepét vetették fel mind nem-hemopoetikus eredetű sejtek (fibroblasztok, neuronok) [87-90], mind neutrofilek [119]

integrin-jelátvitelében. Ezért szerettük volna megvizsgálni, hogy hogyan alakul a neutrofilek integrineken keresztüli jelátvitele a p190RhoGAP genetikai hiányában. Dr. Jeffrey Settleman (Massachussets General Hospital, Boston, MA, USA) munkacsoportja korábban létrehozott egy p190RhoGAP-mutáns egértörzset, melyben a p190RhoGAP-ot kódoló gén első exonjának 5' részét cserélték le egy fordított orientációban beillesztett neomicin-rezisztencia (Neo) kazettával (p190RhoGAP^hypo mutáció; ld. 44. ábra A része). Bár ezzel eltávolították a p190RhoGAP normál transzlációjának megindításáért felelős ATG kodont, utólag kiderült, hogy a Neo kazettától disztálisan elhelyezkedő rejtett "in-frame" ATG kodonról a mutáns egerekben is elindul a transzláció, és abból a normál p190RhoGAP-pal összevethető mennyiségben keletkezik egy N-terminálisan csonkolt fehérje. Ez a mutáció tehát hipomorf mutációnak bizonyult. A rejtett ATG használatát az tette lehetővé, hogy az mRNS-en ettől 5' irányban nem volt jelen más, a riboszóma által felismerhető és fehérjére fordítható szekvencia.

A fentiek tükrében Dr. Jeffrey Settleman munkacsoportja egy újabb stratégiával létrehozott egy második, teljes fehérjehiányt eredményező p190RhoGAP-mutációt is (p190RhoGAP^– mutáció). A munkacsoport időközbeni profilváltása miatt azonban a mutációt nem jellemezték és nem közölték, a létrehozásával kapcsolatos adatok jelentős része elveszett és a mutációt hordozó egértörzs a kihalás szélére került. Az egértözset ebben a fázisban kaptuk meg Dr. Settleman munkacsoportjától, és a Semmelweis Egyetemen elkezdtük a p190RhoGAP^– mutációt hordozó egérkolónia megalapítását és a mutáció genetikai és fenotípusos jellemzését.

Alább bemutatandó kísérleteink kezdetén még a p190RhoGAP^– mutáció létrehozásának részletei sem álltak a rendelkezésünkre, és a kapott genotipizálási protokoll nem működött és nem volt értelmezhető. Mindössze annyit tudtunk, hogy a mutáns allélnek hordoznia kell a Neo kazettát és hogy a p190RhoGAP^–/– egerek feltételezhetően nem életképesek. A továbbiakban először a Neo kazetta ismert szekvenciája alapján tervezett primerpárral sikerült azonosítanunk a p190RhoGAP^– mutációt feltételezhetően hordozó egereket, majd ennek az információnak a segítségével megterveztünk és beállítottunk egy, a p190RhoGAP^– mutációra specifikus allél-specifikus PCR-reakciót [14] (a Neo belső szevenciája alapján tervezett PCR minden Neo-t tartalmazó mutációt felismert, tehát nem volt specifikus a p190RhoGAP^– mutációra). A továbbiakban a teljes mutációt hordozó genomikus DNS-szakasz többlépéses átfedő PCR-felerősítésével és szekvenálásával utólagosan meghatároztuk a mutáns allél nukleotidsorrendjét és a Settleman doktortól kapott részleges információkkal összevetve rekonstruáltuk a mutáció létrehozásának stratégiáját és menetét. Az így kapott eredményeket mutatja a 44. ábra.

Amint az a 44. ábra A részén látható, a p190RhoGAP^– mutáció létrehozása során az a β-galaktozidáz és a neomicin-rezisztenciáért felelős aminoglikozid-foszfotranszferáz aktivitásával egyaránt rendelkező β-Geo (β-Gal–Neo) fúziós fehérjét kódoló kazettát a p190RhoGAP-ot kódoló génnek megfelelő ("szenz") orientációban illesztettek be az első exon 5' végén genomba. Ennek eredményeképpen a Neo aktivitás lehetővé tette a mutánsok azonosítását (pozitív szelekció), a β-Gal aktivitás követésével vizsgálni lehetett a

Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele rejtett ATG-től 5' irányban elhelyezkedő teljes olvasási keret ("open reading frame") jelenléte miatt a rejtett ATG-től kiindulva már nem jött létre másodlagos csonkolt p190RhoGAP fehérje.

A 44. ábra B része részletesen mutatja a felhasznált targetáló vektort. A korábbiakban említett β-Geo kazetta mellett a vektor tartalmazott egy további (negatív) szelekciós kazettát is, mely a foszfoglicerát-kináz (PGK) konstitutív promotere által hajtva expresszálta a diftéria-toxin citotoxikus A komponensét (DTA). Ez a knockout állatok létrehozásakor rutinszerűen alkalmazott módszer biztosította, hogy a vektornak a genomba való esetleges véletlen integrációja az adott sejt DTA általi elpusztításához vezessen, és ilymódon csak azok a mutáns klónok maradjanak fent, melyekben a vektor beépülése a β-Geo és a PGK-DTA közti szakaszon kilalakuló homológ rekombináció révén jöttek létre.

A keletkezett neomicin-rezisztens embrionális őssejt (ES sejt) klónok közül a genomiális DNS HindIII restrikciós enzimmel való hasítása után a 44. ábra B részén piros téglalappal jelölt szakaszra felfekvő próbával végzett Southern Blot vizsgálattal tudták kiválasztani a tervezettnek megfelelő mutációt hordozó klónokat. Egy ilyen vizsgálat eredményét mutatja a 44. ábra C része, melyen a 3.2 kb magasságban megjelenő szignál a tervezettnek megfelelő mutáció jelenlétét jelzi. További, a p190RhoGAP^hypo/hypo mutációval való közvetlen összehasonlítás során kimutattuk, hogy a p190RhoGAP^– mutációt hordozó ES sejtek nem expresszálják a p190RhoGAP^hypo allél által kódolthoz hasonló csonkolt p190RhoGAP fehérjét [14].

A p190RhoGAP^– mutációt a továbbiakban heterozigóta (p190RhoGAP^+/–) formában tartottuk fent. A mutáns vonal stabilizálódása után heterozigóták időzített keresztezésével megpróbáltunk homozigóta knockout (p190RhoGAP^–/–) magzatokat nyerni. A kapott magzatokat egyrészt genomiális DNS-ből végzett allél-specifikus PCR-reakció, másrészt a magzatok agylizátumán végzett immunoblot módszer segítségével vizsgáltuk. Egy ilyen vizsgálat eredményét mutatja a 45. ábra A része, melyen jól látható, hogy a PCR-alapú genotipizálás eredményével egybehangzóan a homozigóta knockout (p190RhoGAP^–/–) magzatok nagy mennyiségben expresszálták a β-galaktozidázt, de két különböző p190RhoGAP-ellenes antitesttel (melyek közül az egyik a fehérje középső szakaszát ismeri fel) sem tudtuk bennük kimutatni a p190RhoGAP fehérjét. A homozigóta vad típusú (p190RhoGAP^+/+) magzatok ezzel szemben expresszálták a p190RhoGAP-ot, de nem fejezték ki a β-galaktozidázt. Várakozásainknak megfelelően a p190RhoGAP^+/– heterozigóta

A B

C +/– +/– +/+ +/– +/– +/–

Exon 1 B

E H

E B X

ß-Geo PGK-DTA

E B X

ß-Geo 3.8 kb

H H

3.2 kb Vad típusú allél

Knockout allél Targetáló vektor

H X

– 3.8 kb – 3.2 kb Vad típus –

Knockout – p190RhoGAP^{hy po}

(hipomorf) allél ^{Exon 1}

ATG

GAP

Exon 1 ATG

ß-Geo

ß-Gal N eo p190RhoGAP^–

(knockout) allél

ATG STOP

Exon 1

ATG ATG

GTPáz GAP

p190RhoGAP⁺ (vad típusú) allél

Neo Neo

(csonkolt p190RhoGAP) (p190RhoGAP)

44. ábra: A p190RhoGAP-ot kódoló gén különböző alléljeinek sémája (A), a "knockout" allél létrehozásának stratégiája (B) és a kapott mutáció ellenőrzése (C). H: HindIII; E: EcoRI; B: BamHI; X: XbaI; Publikálva: [14].

Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele állatok mind a p190RhoGAP, mind (bár a p190RhoGAP^–/– magzatoknál alacsonyabb szinten) a β-galaktozidáz fehérjét is expresszálták.

A p190RhoGAP^+/– × p190RhoGAP^+/– keresztezésből származó magzatok genotípusának nagyobb mintán való vizsgálata kimutatta, hogy a harmadik trimeszterben a magzatoknak a várt 25%-nál valamivel kevesebb, mintegy 18%-a volt p190RhoGAP^–/–

genotípusú [14]. Az ugyanilyen keresztezésből származó, megszületett és 2-3 hetes korban genotipizált egerek között pedig egyáltalán nem találtunk p190RhoGAP^–/– genotípusúakat [14]. A p190RhoGAP^–/– magzatok részletes vizsgálata során ezen túl számos esetben a velőűr záródásának károsodására utaló jeleket figyeltünk meg (egy jellegzetes esetet mutat a 45. ábra B része, melyen a p190RhoGAP^–/– magzat koponyájának és a kaudális gerincvelőnek a záródási zavara látható). Makroszkópos velőűr-záródási zavar a p190RhoGAP^–/– magzatok kb. 30%-ában volt megfigyelhető [14].

A fentiek alapján elmondhatjuk, hogy a p190RhoGAP^–/– mutáció az embrionális korban kisebb mértékű elhalálozást, a születés körül viszont teljes életképtelenséget eredményez. A p190RhoGAP hiánya ezen túl a magzatok egy részében velőűr-záródási rendellenességgel jár. Ezek a megfigyelések nagyon hasonlóak p190RhoGAP^hypo/hypo mutánsokban megfigyeltekhez, ami arra utal, hogy a p190RhoGAP^hypo/hypo mutáció a teljes génhiányhoz hasonló tüneteket eredményez.

Mivel minket elsősorban a p190RhoGAP-nak a neutrofilekben betöltött szerepe érdekelt, a továbbiakban az 22. ábrán bemutatott módszernek megfelelően időzített terhességből származó p190RhoGAP^–/– és vad típusú kontroll (p190RhoGAP^+/+ vagy p190RhoGAP^+/–) magzatok májsejtjeit letálisan besugárzott CD45.1-et hordozó recipiensekbe transzplantáltuk. A transzplantáció során a p190RhoGAP^–/– magzatokat az agylizátumokból, felgyorsított immunoblot

módszerrel azonosítottuk (ez az allél-specifikus PCR-nál megbízhatóbb módszernek bizonyult). A transzplantáció sikerességét a vérben keringő neutrofilek CD45.2 expressziójának (a donor sejtekre jellemző markernek) az áramlási citometriás vizsgálatával ellenőriztük (46.

ábra A része). Kimutattuk továbbá, hogy a p190RhoGAP^–/– kimérákból izolált

1 2 3 4 5 6 7

+/– –/– +/– –/– +/– –/– +/+

p190RhoGAP^–/–

Vad típus

Western BlotPCR

Mutáns allél – Vad típusú allél –

Aktin – β-galaktozidáz – p190RhoGAP ("30") – p190RhoGAP (D2D6) –

B

Magzat száma:

Genotípus:

A

45. ábra: A p190RhoGAP^–/– magzatok azonosítása (A) és magzati fenotípusa (B). Publikálva: [14].

A

B

CD45.2

p190RhoGAP^–/–

Vad típus

Eseményszám

– p190RhoGAP – Aktin Recipiens

Donor Kiméra

46. ábra: p190RhoGAP^–/– csontvelő-kimérákból származó neutrofilek ellenőrzése áramlási citometriával (A) és estern

Blot módszerrel (B). Publikálva: [14]

Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele neutrofilekben ténylegesen hiányzik a p190RhoGAP fehérje (46. ábra B része). A p190RhoGAP hiánya nem befolyásolta sem a Gr1 granulocita-érési marker, sem a vizsgált integrin-láncok és Fc-receptorok sejtfelszíni expresszióját [14]. A továbbiakban az ilymódon létrehozott és ellenőrzött p190RhoGAP^–/– és kontroll csontvelői kimérákból izolált neutrofileket vizsgáltuk.

7.1.8. A p190RhoGAP vizsgálata neutrofilek integrin-függő aktiválódásában