Az autoantitest-indukált K/B×N szérum-transzfer arthritis modell

A K/B×N szérumtranszfer-arthritis alapja egy véletlen megfigyelés volt, melynek során egy más célból létrehozott, az ún. KRN transzgénikus T-sejt-receptort hordozó egértörzset az autoimmunitásra hajlamosító NOD egértörzzsel való keresztezésből kapott utódokat vizsgáltak [108]. Ezeket az egereket a szülők

eredete és a KRN transzgént hordozó törzs C57BL/6 (röviden B6) genetikai háttere alapján KRN/B6×NOD, rövidítve K/B×N egereknek nevezzük el (91. ábra). A K/B×N egereken súlyos ízületi gyulladást figyeltek meg, amely klinikai tüneteiben és szövettani képében (pl. a jellegzetes pannus megjelenésében) is nagyon hasonlított a humán rheumatoid arthritishez [108]. A modell további vizsgálata során kiderült, hogy a betegség

KRN transzgén

B6 háttéren × NOD

K/B×N utódok

Szérum recipiens Szérum

transzfer Arthritis

91. ábra: A K/B×N szérum-transzfer arthritis-modell sematikus ábrázolása.

Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele genetikailag normális egyedekre is átvihető a K/B×N állatok szérumával vagy tisztított immunglobulinjaival (91. ábra) [140]. Az ilymódon kiváltott betegségmodell a K/B×N szérumtranszfer-arthritis.

A K/B×N szérumtranszfer arthritis modell a saját kísérleteink szempontjából számos előnnyel rendelkezik. Egyrészt ez a modell a nemzetközi szakirodalomban általánosan használt és elismert modell, ami megkönnyítette eredményeink másokéival való összehasonlítását és szélesebb körű megismertetését. A modell kifejezetten robusztus, és (ellentétben pl. a kollagén-indukált vagy kollagén-antitest-indukált arthritisszel) minden eddig vizsgált egértörzsben, köztük a saját egereink hátterét adó C57BL/6 egerekben is működik.

A modell lehetőséget teremt az autoimmun arthritis késői (szövetkárosodási) fázisának a limfociták által közvetített korai (immunizációs) fázistól független vizsgálatára. Korábbi irodalmi adatok ezeken túlmenően igazolták, hogy a K/B×N szérumtranszfer-arthritis létrejöttében fontos szerepet játszanak a neutrofilek [141], a makrofágok [142] és a hízósejtek [143], valamint a β2-integrinek [144] és az Fcγ-receptorok [145-147], vagyis a korábbi kísérleteink tárgyát képező sejtek és receptorok.

A K/B×N szérumtranszfer-arthritis beállításához először meg kellett alapítanunk egy, a KRN transzgént a C57BL/6 genetikai háttéren hordozó egértörzset. Mivel a KRN transzgén-pozitív és a transzgén-negatív egyedek között külsőleg semmilyen különbség nincs (a NOD egerekkel való keresztezés nélkül nem jön létre arthritis), a KRN transzgén-pozitív egereket egyedi genotipizálás alapján kellett azonosítanunk. Ehhez kezdetben a KRN T-sejt-receptor-transzgén részét képező Vβ6 régió áramlási citometriával való kimutatását (92. ábra A panel), a későbbiekben pedig a transzgén PCR-alapú kimutatását (92. ábra B panel) alkalmaztuk.

A KRN transzgén-pozitív egyedek NOD egerekkel való keresztezéséből származó utódok közül a 92. ábra szerinti genotipizálás és a látható arthritis alapján választottuk külön a transzgén-pozitív (K/B×N; arthritises) és a transzgén-negatív (B×N; egészséges) egereket.

A kétféle egerek szérumát külön-külön összegyűjtöttük. A K/B×N egerek szérumát használtuk a szérumtranszfer-arthritis kiváltására, míg a kontroll egerek az egészséges (B×N) egerekből származó szérumot kaptak.

A K/B×N szérumtranszfer-arthritist rutinszerűen egyszeri 400 µl K/B×N szérum intraperitoneális injekciójával váltottuk ki. A kontroll egerek azonos mennyiségű normál (B×N) szérumot kaptak. A K/B×N szérum hatására létrejövő ízületi gyulladást mutatja a 93. ábra A része, melyen jól látható a bokatájék és a lábujjak duzzanata, a szövetek vöröses színezete és a végtag deformációja. A betegséget a K/B×N szérum adását követő két héten keresztül

Egér száma: 36 37 38 39 40 41 42 43 44

KRN genotípus: + – – – – + – – +

TCR Vβ6 TCR Vβ6

M KRN Transzgén-pozitív

A B

Tg⁺

Eseményszám

KRN Transzgén-negatív

Kontroll PCR

(450 bp) – 500 bp

– 100 bp – 1500 bp

KRN PCR (190 bp)

92. ábra: A KRN transzgénikus egerek genotipizálása a perifériás vérben keringő CD4+ sejtek Vβ6 T-sejt-receptorának (TCR) áramlási citometriás vizsgálatával (A), illetve genomiális DNS KRN transzgénre specifikus

PCR vizsgálatával (B). Tg⁺: KRN transzgén-pozitív kontroll minta; M: molekulatömeg-marker; bp: bázispár.

Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele minden nap számszerűsítettük is a látható tünetek 0-10 közötti hátsó végtagi klinikai pontszám-skálán való értékelésével (93. ábra B panel) és rugós tolómérő segítségével minden nap lemértük az egerek bokavastagságát is (93. ábra C panel). Az így kapott kinetikai görbéken jól látszik, hogy az arthritis a K/B×N szérum injekcióját követő 2-3 nap múlva kezd megjelenni és a 8-10. napon éri el a maximumát (93. ábra B-C panel). Itt nem bemutatott továbbkövetéses kísérleteinkben azt tapasztaltuk, hogy a K/B×N szérum injekcióját követő 3. héten a betegség már kezd lecsengeni, ami feltételezhetően az arthritogén antitesteknek a szervezetből való kiürülésével magyarázható.

Mivel a humán rheumatoid arthritis egyik legsúlyosabb következménye az ízületi funkció (fogás, írás, stb.) elvesztése, beállítottunk egy kísérleti rendszert az egerek ízületi funkciójának a vizsgálatára is. Ennek során az egereket egy, a ketrecfedélhez hasonló rácsozattal rendelkező, speciálisan erre a célra készített fémrácsra helyeztük, majd a rácsot megfordítva szimuláltuk azt az állapotot, amikor az egerek a ketrecdobozukban alulról kapaszkodnak az azt fedő rácsra. Ezután megmértük, hogy az egerek hány másodpercig képesek kapaszkodni a rács aljához. A vizsgálat eredményét a 94. ábra A részén bemutatott képkockák és a mért időtartamokból a Kaplan-Meier túlélési görbéhez hasonlóan képzett és a 94. ábra B részén bemutatott "rácson-maradási görbék" szemléltetik (utóbbiak azt mutatják, hogy adott idő elteltével az egerek hány százaléka kapaszkodik még mindig a rácson). Az ábráról leolvasható, hogy míg a kontroll (B×N) szérummal kezelt egerek kb.

90%-a 20 másodpercnél tovább volt képes kapaszkodni a rácson, addig az arthritist kiváltó (K/B×N) szérummal való kezelést követően az állatok fele az első másodpercekben leesett a rácsról és elhanyagolható részük volt képes a teljes 20 másodperces mérési időszakban a rácson maradni.

Arthritis

B C

A

Kontroll

0 2 4 6 8

0 2 4 6 8 10 12 14

Idő (nap) Klinikai pontszám (max. 10)

Kontroll Arthritis

2.5 3 3.5 4

0 2 4 6 8 10 12 14

Idő (nap) Bokavastagság (mm)

Kontroll Arthritis

93. ábra: K/B×N szérum-transzfer arthritis vad típusú egerekben. Publikálva: [13]

Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele

Amint azt a fentiekben említettem, a K/B×N szérumtranszfer-arthritis iránti érdeklődésünk egyik oka az volt, hogy korábbi irodalmi adatok szerint a betegség kialakulásához elengedhetetlenek a β2 -integrinek és az Fcγ-receptorok [144,145].

Ezeket a következtetéseket megpróbáltuk a saját kísérleti rendszerünkben magunk is megerősíteni. Amint azt a 95. ábra A és C része mutatja, a K/B×N szérumtranszfer-arthritis makroszkóposan látható klinikai tünetei és a bokavastagság emelkedése egyaránt majdnem teljesen elmaradt a CD18^–/– csontvelői kimérákban.

Hasonlóképpen a betegség klinikai tünetei és a bokavastagság emelkedése teljesen megszűnt az aktiváló Fcγ-receptorok működéséhez szükséges FcRγ adapter-fehérje hiányában (95. ábra B és D panel).