7. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS
7.2. Jelátviteli folyamatok vizsgálata a neutrofilek sejtvándorlása során
7.2.4. A PLCγ2 részvételének vizsgálata neutrofilek sejtvándorlásában
A következő kísérletekben a PLCγ2 szerepét vizsgáltuk a neutrofilek vándorlásában a fentiekhez hasonló in vitro és in vivo megközelítésekkel. Amint az a 65. ábra A részén látható, a PLCγ2 hiánya in vitro Transwell rendszerben nem okozott jelentős változást a neutrofilek fMLP irányában való vándorlásában, bár az alacsonyabb fMLP-koncentrációk melletti részleges károsodás és a magasabb fMLP-koncentrációk melletti kismértékű fokozódás a PLCγ2–/– sejtek esetében is megfigyelhető volt. A PLCγ2 szerepét kevert csontvelői kimérákon elvégzett tioglikollát peritonitis módszerrel is vizsgáltuk. Ebben a kísérletsorozatban további kontrollként végeztünk olyan kísérleteket is, melyekben a CD45.1-et expresszáló vad típusú csontvelői sejtek mellCD45.1-ett CD45.2-t expresszáló vad típusú sejtek voltak jelen (tehát a vad típusú sejtek egymással való "versengését" vizsgáltuk). Amint az a 65. ábra B részén látható, várakozásaink szerint ezek a sejtek egymáshoz hasonló mértékben voltak képesek felszaporodni a gyulladt peritoneális térben. A PLCγ2–/– sejtek hasonló módon való vizsgálata kimutatta, hogy a PLCγ2 hiánya nem csökkentette, sőt kismértékben fokozta is a neutrofilek bejutását a peritoneumba. Az eredmények számszerűsítése során a PLCγ2–/– neutrofilek relatív migrációs kapacitása a vad típusú sejtek közel kétszeresének adódott (65. ábra C panel).
Dr. Markus Sperandio (Ludwig-Maximilians Universität, München, Németország) munkacsoportjával együttműködve további intravitális mikroszkópos és hisztológiai vizsgálatokat végeztünk a PLCγ2 leukociták in vivo vándorlásában betöltött szerepének vizsgálatára kívülről adott fMLP-vel kezelt cremaster izom venuláiban. Itt be nem mutatott kísérleteinkben azt találtuk, hogy bár a leukociták éren belüli adhéziója és szétterülése jelentős mértékben károsodott a PLCγ2 hiányában, ez nem befolyásolta a PLCγ2–/–
leukocitáknak az érfalon való átjutását [13].
Összességében tehát elmondhatjuk, hogy –a Syk-hez, az Src-kinázokhoz és az ITAM-tartalmú adapter-fehérjékhez hasonlóan– a PLCγ2 sem játszik elengedhetetlen szerepet a neutrofilek integrin-függő migrációjában.
A In vitro Transwell migráció C Relatív migráció
(in vivo) Vad típus/PLCγ2–/– (CD45.2) :
Vad típus (CD45.1) kevert csontvelői kimérák
B
0 20 40 60 80 100
0 20 40 60 80 100
CD45.2 PMN aránya a vérben (összes PMN %-ában) CD45.2 PMN aránya a peritoneumban (összes PMN %-ában)
Vad típus : Vad típus PLCγ2–/– : Vad típus
0 10 20 30
0 0.1 0.3 1 3 10
fMLP (µM) Migrált sejtek száma (összes %-ában)
Vad típus PLCγ2–/–
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Vad típus
PLCγ2–/–
Relatív migráció (CD45.1-hez képest)
65. ábra: A PLCγ2 szerepének vizsgálata neutrofilek sejtvándorlásában in vitro Transwell assay-ben (A) és kevert kimérákban tioglikoláttal kiváltott in vivo steril peritonitis során (B-C). A C panel a B panel eredményeiből
számolt relatív migrációt mutatja. Publikálva: [13].
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele 7.2.5. A p190RhoGAP szerepének vizsgálata a sejtvándorlásban
A következő kísérletekben a p190RhoGAP szerepét vizsgáltuk neutrofilek in vitro és in vivo migrációja során. A p190RhoGAP-nak a korábbi irodalmi adatok alapján az integrinek jelátvitelében betöltött feltételezett szerepe miatt a kísérleteket párhuzamosan elvégeztük CD18–/– neutrofileken is. Amint az a 66. ábra A részén látható, a p190RhoGAP hiánya az alkalmazott fMLP-koncentrációk mellett nem csökkentette (sőt kismértékben fokozta) a neutrofilek vándorlását in vitro Transwell rendszerben, míg ugyanezen körülmények között a CD18–/– sejtek vándorlása lényegében teljesen megszűnt. A kevert csontvelő-kimérákon végzett in vivo peritonitis-kísérletek során (66. ábra B része) korábbi eredményeinknek megfelelően azt tapasztaltuk, hogy a CD45.1-et expresszáló vad típusú sejtekhez képest a CD45.2-t expresszáló vad típusú sejtek hasonló, a CD18–/– sejtek pedig jelentősen csökkent migrációt mutattak. A p190RhoGAP–/– sejtek ebben a kísérletsorozatban a vad típusú sejtekhez hasonlóan viselkedtek, bár kismértékben azoknál nagyobb hatékonysággal is akkumulálódtak a gyulladt peritoneumban. Ezt az összképet az eredményekből számolt relatív migrációs értékek is megerősítették (66. ábra C része).
A fentieken túl Barbara Walzog munkacsoportjával együttműködve in vitro Zigmond-kamrában is vizsgáltuk a p190RhoGAP–/– neutrofilek irányított vándorlását. Itt be nem mutatott kísérleteinkben azt tapasztaltuk, hogy a p190RhoGAP hiánya egyik vizsgált paraméter szempontjából sem befolyásolta a neutrofilek fMLP-grádiens irányában való vándorlását [14].
Összességében tehát megállapíthatjuk, hogy a p190RhoGAP sem in vitro, sem in vivo körülmények között nem játszik megkerülhetetlen szerepet a neutrofilek integrin-függő sejtvándorlásában.
7.2.6. Megbeszélés
A neutrofilek sejtvándorlásának fent bemutatott vizsgálata során azt szerettük volna tanulmányozni, hogy a β2-integrinek jelátvitelében adherens aktiváció során fontos szerepet játszó jelátviteli fehérjék (Syk, DAP12/FcRγ, Src-család és PLCγ2) részt vesznek-e a neutrofilek β2-integrin-függő migrációs aktivitásában is. Meglepődve tapasztaltuk, hogy a Syk és az Src-típusú kinázok adherens aktivációban betöltött szerepe (25-26. és 28-30. ábra)
Vad típus/CD18–/–/p190RhoGAP–/– C
(CD45.2) : Vad típus (CD45.1) kevert csontvelői kimérák
Relatív migráció (in vivo)
A
In vitro Transwell migráció
B
0 0.5 1 1.5
Vad típus
CD18–/– p190Rho GAP–/–
Relatív migráció (CD45.1-hez képest)
0 20 40 60 80 100
0 20 40 60 80 100
CD45.2 PMN aránya a vérben (összes PMN %-ában) CD45.2 PMN aránya a peritoneumban (összes PMN %-ában)
Vad típus : Vad típus CD18–/– : Vad típus p190RhoGAP–/– : Vad típus
0 5 10 15 20 25
– 3 10
fMLP (µM) Migrált sejtek száma (összes %-ában)
Vad típus CD18–/–
p190RhoGAP–/–
66. ábra: A CD18 és a p190RhoGAP szerepének vizsgálata neutrofilek sejtvándorlásában in vitro Transwell assay-ben (A) és kevert kimérákban tioglikoláttal kiváltott in vivo steril peritonitis során (B-C). A C panel a B
panel eredményeiből számolt relatív migrációt mutatja. Publikálva: [14].
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele [2,33,114] ellenére sem in vitro, sem in vivo körülmények között nem sikerült kimutatnunk a fehérjéknek a sejtmigrációban való elengedhetetlen
szerepét (56-58. és 62-63. ábra) [2,10]. További kísérleteinkben hasonló különbséget tapasztaltunk az adherens aktiváció és a sejtvándorlás között a DAP12 és FcRγ (vö. 31-32. és 64. ábrákat) [8], illetve a PLCγ2 (vö. 40-42. és 65. ábrákat) [13] esetében. Mindezek alapján összességében elmondhatjuk, hogy a neutrofilek β2-integrin-függő adherens aktiválódásához és β2-integrin-függő sejtvándorlásához különböző jelátviteli folyamatok szükségesek (67. ábra). Míg előbbihez az immunreceptorok jelátviteléhez hasonlóan feltételezhetően elengedhetetlen az Src-család–DAP12/FcRγ–Syk–PLCγ2 jelátviteli tengely, addig az utóbbihoz ezen fehérjék egyike sem szükséges.
Az β2-integrin-függő adherens aktiváció és migráció közti jelátviteli különbség komoly meglepetést váltott ki és eleinte sokan kételkedve fogadták az eredményeinket. Részben ez volt az oka annak, hogy több különböző kísérleti rendszerben és számos kontroll kísérlet közbeiktatásával végeztük a kísérleteinket. Az Src-család–DAP12/FcRγ–Syk–PLCγ2 jelpálya döntő szerepe ellen négy különböző, közülük két in vitro (Transwell és Zigmond kamra) és két in vivo (tioglikollát peritonitis és a cremaster-izom venuláinak intravitális vizsgálata) migrációs rendszerben kapott eredményeink szólnak. Ezek közül az első három rendszerben saját magunk is megerősítettük a CD18 elengedhetetlen szerepét. Az alkalmazott kísérleti megközelítések (köztük a kevert kimérákon elvégzett önkontrollos peritonitis-kísérletek, illetve a sejtek közvetlen megfigyelése a Zigmond-kamrákban) minimális lehetőséget hagynak az eredmények esetleges félreértelmezésére. Összességében tehát az itt bemutatott nagy mennyiségű kísérleti eredmény együttesen nagyon erős érvet szolgáltat a CD18-on keresztüli kétféle sejtválasz különbözőségére.
A β2-integrin-függő adherens aktiváció és migráció jelátviteli folyamatai közti különbség oka mindmáig nem tisztázott. Elképzelhető, hogy a két folyamat során a β2-integrinek jelpályája már nagyon korán kettéválik és elkülönül egymástól. Elképzelhető az is, hogy a sejtvándorlás során a β2-integrinekre csak mint passzív adhéziós receptorokra van szükség, de ezek a receptorok nem indítanak el a sejtvándorlás szempontjából fontos jelátviteli folyamatokat. Az is elképzelhető, hogy az Src-család–DAP12/FcRγ–Syk–PLCγ2 jelpálya olyan speciális (pl. citoszkeletális) folyamatok kiváltásában játszik szerepet, melyek szükségesek az adherens aktivációhoz (szétterülés, szuperoxid-termelés, degranuláció) de nem vesznek részt a sejtmigráció létrejöttében. Végül nem szabad elfeledkeznünk arról sem, hogy a CD18 genetikai hiánya nem csak egyetlen molekulapár, hanem a β2-integrinek családjába tartozó több különböző homodimer expresszióját csökkenti. Elképzelhető, sőt egyes irodalmi adatok és saját nem publikált eredményeink utalnak is rá, hogy ezek közül az adherens aktivációban elsősorban a Mac-1 (αMβ2; CD11b/CD18), míg a migrációban az LFA-1 (αLβ2; CD11a/CD18) vesz részt. Ebben az esetben elképzelhető, hogy az Src-család–
DAP12/FcRγ–Syk–PLCγ2 jelpálya specifikusan a Mac-1 jelátvitelében szerepel (pl. az αM lánc jelátviteli folyamatain keresztül), így szükséges a Mac-1-függő adherens aktivációhoz, de nem vesz részt az LFA-1-függő migrációs folyamatokban (67. ábra)
Syk Src-család
PLCγ2 DAP12/FcRγ Syk
Src-család
β2-integrinek
Adherens aktiváció PLCγ2 DAP12/FcRγ
Migráció
(Mac-1) (LFA-1)
67. ábra: A β2-integrin-függő adherens aktiváció és migráció eltérő jelpályái
neutrofilekben.
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele Összességében elmondhatjuk, hogy a fent bemutatott migrációs kísérletek által sikerült tisztáznunk a β2-függő sejtvándorlás jelátvitelének fontos aspektusait, melyek új megvilágításba helyezték a neutrofilek vándorlásának mechanizmusáról alkotott elképzeléseinket.
7.3. Az Fc-receptorok szerepének és jelátvitelének vizsgálata neutrofilekben
Az immunkomplexek általi neutrofil-aktiváció fontos pathogenetikai szerepet játszik számos betegség, köztük az autoimmun vasculitisek, egyes glomerulonephritis-formák és a rheumatoid arthritis patomechanizmusa egyes aspektusainak létrejöttében. Mivel ezen esetekben a neutrofilek aktivációja elsősorban felülethez kötött IgG immunkomplexeken keresztül jön létre, munkacsoportunkban beállítottuk és vizsgáltuk a neutrofilek immobilizált immunkomplexek általi aktivációját.
7.3.1. Neutrofilek aktiválódása immobilizált immunkomplexek által
A neutrofilek immunkomplexek általi aktiválódását a sejtek immobilizált immunkomplex-felszínre helyezésével értük el további szolúbilis stimulus
alkalmazása nélkül (68. ábra). Ezen kísérletek során ELISA-lemezek üregeit először antigén-oldattal, majd (a szabad kötőhelyek blokkolása után) az adott antigén elleni antitest oldatával inkubáltuk. Az így kezelt felszínre helyeztük a neutrofileket, majd vizsgáltuk azok funkcionális válaszkészségét.
Kísérleteink első részében humán neutrofileken vizsgáltuk az immobilizált immunkomplexek által kiváltott sejtválaszokat. Amint az a 69. ábra A részén látható, humán szérumalbumin (HSA) és nyúl poliklonális anti-HSA antitestek által képzett immobilizált immunkomplexek a humán neutrofilek nagymértékű szabadgyök-termelését váltották ki, míg bármelyik komponens elhagyása esetén a válasz nem jött létre. HSA–anti-HSA immunkomplexeken kívül jól mérhető választ kaptunk az ovalbumin (Ova) és anti-Ova, illetve a laktoferrin (Lfr) és anti-Lfr immunkomplexekkel is, míg a nem azonos specificitású antigén-antitest párok nem váltottak ki sejtaktiválódást (69. ábra B része). Az immobilizált immunkomplexek a szuperoxid-termelés mellett a zselatináz-granulumok ürülését és a sejtek szétterülését is kiváltották (49. ábra C-D része).
[1-34]
68. ábra: A neutrofilek aktiválódása immobilizált immunkomplexek által
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele
Annak igazolására, hogy a fenti sejtválaszokat az alkalmazott immunglobulinok Fc része váltja ki, pepszines hasítás révén a
poliklonális anti-HSA antitestből F(ab')2 fragmenseket készítettünk, és ezekkel is megkíséreltük a humán neutrofilek aktiválását. Amint a 70. ábra A részén látható, az anti-HSA antitest F(ab')2 fragmense nem volt képes a neutrofilek aktiválására. Annak ellenőrzésére, hogy a sejtválasz hiánya nem az F(ab')2 fragmensek lekötődésének a zavara miatt jön-e létre, az antitestek Fab és Fc részeire specifikus másodlagos antitestekkel megvizsgáltuk a különböző anti-HSA antitest-preparátumok lekötődését az
immobilizált HSA-hoz. Várakozásainknak megfelelően a nyúl IgG Fc-része ellen termeltetett másodlagos antitest csak a teljes anti-HSA lekötésekor adott jelet, míg a nyúl IgG Fab-részét felismerő másodlagos antitesttel a lekötődött teljes anti-HSA antitestek és anti-HSA F(ab')2 fragmensek egyaránt jelölődtek. Az F(ab')2 fragmenseket tehát sikerült hatékonyan lekötnünk az immobilizált HSA antigénekhez, de az F(ab')2-t tartalmazó immunkomplexek az Fc-rész hiánya miatt nem voltak képesek a neutrofilek aktiválására.
A következőkben összehasonlítottuk a neutrofilek immobilizált immunkomplexek általi aktiválódásának a mértékét a sejtek más módon való aktiválódásával. Amint az a 71. ábrán látható, az immunkomplex-kiváltotta
szabadgyök-termelés mind humán, mind egér neutrofilek esetében meghaladta az egyéb alkalmazott fiziológiás stimulusok, köztük a
citokalazin-B-előkezelés után alkalmazott fMLP, a
fibrinogén-felszínen adott TNF vagy az immobilizált anti-CD18 antitestek által kiváltott sejtválaszokat és megközelítette a sejtek legerősebb
A B C D
69. ábra: Immobilizált IgG immunkomplex (IC) által indukált szabadgyök-termelés (A-B), degranuláció (C) és szétterülés (D) humán neutrofilekben. HSA: humán szérum-albumin; Ova: ovabumin; Lfr: laktoferrin. Publikálva:
[12]
70. ábra: Teljes IgG antitestet és F(ab')2 IgG-t tartalmazó immunkomplexek hatása humán neutrofilek aktiválódására (A) és az antitestek felszíni
lekötődésének ellenőrzése (B). OD: optikai denzitás.
Publikálva: [12].
71. ábra: Immobilizált IgG immunkomplexek (IC) és egyéb sejtaktiválási módok hatásának összehasonlítása humán (A)
és egér (B) neutrofilekben (PMN). CB: citokalazin B; Fbg:
fibrinogén. Publikálva: [12].
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele ismert aktivátorának, a nem-fiziológiás mechanizmusokon keresztül ható PMA-nak a hatását.
7.3.2. Fc-receptorok azonosítása neutrofilek immunkomplex-általi aktivációjában
Bár az immunkomplex-mediált neutrofil aktiváció által kiváltott kórfolyamatokat leggyakrabban kísérleti egereken modellezik, kísérleteink kezdetén egyáltalán nem volt ismert, hogy mely Fc-receptorok vesznek részt az egér neutrofilek immunkomplex-indukált aktiválódásában. Ennek egyik lehetséges magyarázata az volt, hogy az egér neutrofilek felszínén nagy mennyiségben jelen levő FcγRIV fehérjét csak kísérleteink előtt néhány évvel azonosították [130]. A következőkben ezért megpróbáltuk azonosítani az egér neutrofilek immunkomplex-kiváltotta aktiválódásában szerepet játszó Fc-receptorokat.
Amint azt az 72. ábra mutatja, FcRγ–/– neutrofilekben teljesen megszűnt az immunkomplex-indukált szabadgyök-termelés, degranuláció és szétterülés. Ez arra utalt, hogy az immunkomplexek FcRγ-hoz kapcsolódó Fc-receptorokon keresztül aktiválják az egér neutrofileket.
Az egér mieloid sejtek felszínén jelen levő FcRγ-asszociált receptorok közül legismertebbek az FcγRIII és az FcγRI, melyek közül az előbbi nagy mennyiségben van jelen egér neutrofilek felszínén, de az utóbbi is megjelenhet a sejtek aktivációja során [131].
Amint azt az 74. ábra mutatja, önmagában sem az FcγRIII, sem az FcγRI törlése, de még a két receptor együttes hiánya sem okozta a neutrofilek immunkomplex-indukált válaszképességének a jelentős károsodását (bár az FcγRIII hiánya a sejtválaszok enyhe csökkenését hozta létre). Feltételezhető volt tehát, hogy egy további FcRγ-asszociált receptor ilyen körülmények között is képes létrehozni a neutrofilek aktiválódását.
A B C
Vad típus FcRγ–/–
Kontroll IC Kontroll IC
IC
Zselatináz zimogram
Vad típusFcRγ–/–
Kontroll
0 2 4 6 8
0 20 40 60
Idő (perc) Szuperoxid-termelés (nmol/106 sejt)
Vad típus FcRγ–/–
72. ábra: Immobilizált IgG immunkomplexek (IC) által indukált szabadgyök-termelés (A), degranuláció (B) és szétterülés (C) FcRγ–/– neutrofilekben. Publikálva: [12]
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele
A jelen kísérletsorozatot pár évvel megelőzően Nimmerjahn és munkatársai [130]
azonosítottak egy új FcRγ-asszociált Fcγ-receptort, az FcγRIV-et, mely nagy mennyiségben expresszálódott egér neutrofilek felszínén. Bár az FcγRIV autoimmun betegségmodellekben betöltött szerepét többen is vizsgálták, nem volt tiszta, hogy mely sejttípusokon és milyen sejtválaszokban vesz részt a fehérje. A következőkben megvizsgáltuk az FcγRIV blokkolásának a hatását vad típusú és FcγR3–/– neutrofilek immunkomplex-indukált aktiválódásában.
Amint a 74. ábra A részén látható, mind az FcγR3–/– mutáció, mind az FcγRIV blokkolása kismértékben csökkentette a neutrofilek válaszkészségét, de egyik sem okozta az immunkomplex-indukált szabadgyök-termelés jelentős csökkenését. A két beavatkozás kombinációja (tehát az FcγRIV blokkolása FcγR3–/– sejteken) azonban a szuperoxid-termelés teljes gátlását eredményezte. Ezzel összevethető képet mutatott a degranuláció és a szétterülés vizsgálata, melyeket szintén teljes mértékben gátolt az FcγRIII és az FcγRIV együttes inaktiválása (74. ábra B-C része).
A fenti eredményeket ezután megpróbáltuk megismételni oly módon, hogy antitestekkel blokkoltuk az FcγRIII-t és/vagy az FcγRIV-et. Az FcγRIII esetében ehhez az egér FcγRIII-t és a gátló hatású FcγRIIB-t együttesen gátló FcγRII/III-blokkoló antitesteket alkalmaztunk. Amint az a 75. ábrán látható, a két blokkoló antitest együttes alkalmazása
Kontroll IC Kontroll IC Kontroll IC Kontroll IC
B
FcγR3–/–
+ Izot. kontr.
Vad típus
+ anti-FcγRIV FcγR3–/–
+ anti-FcγRIV Vad típus
+ Izot. kontr.
FcγR3–/–
+ Izot. kontr.
Vad típus + anti-FcγRIV
FcγR3–/–
+ anti-FcγRIV
Zselatináz zimogram
A
KontrollIC
Vad típus + Izot. kontr.
C
0 2 4 6
0 20 40 60
Idő (perc) Szuperoxid-termelés (nmol/106 sejt)
Vad típus + Izot. kontr.
FcγR3–/– + Izot. kontr.
Vad típus + anti-FcγRIV FcγR3–/– + anti-FcγRIV
74. ábra: Immobilizált IgG immunkomplex (IC) által indukált szabadgyök-termelés (A), degranuláció (B) és szétterülés (C) FcγRIV-blokkoló és izotípus kontroll (izot. kontr.) antitesttel kezelt vad típusú és FcγR3–/–
neutrofilekben. Publikálva: [12]
B Vad típus FcγR3–/– FcγR1–/– FcγR1–/–FcγR3–/–
Kontroll IC Kontroll IC Kontroll IC Kontroll IC
C FcγR1–/–FcγR3–/–
Zselatináz zimogram
A
KontrollIC
Vad típus FcγR3–/– FcγR1–/–
0 1 2 3 4 5
0 20 40 60
Idő (perc) Szuperoxid-termelés (nmol/106 sejt)
Vad típus FcγR3–/–
FcγR1–/–
FcγR1–/–FcγR3–/–
73. ábra: Immobilizált IgG immunkomplex (IC) által indukált szabadgyök-termelés (A), degranuláció (B) és szétterülés (C) FcγRI és/vagy FcγRIII genetikai hiányában egér neutrofilekben. Publikálva: [12]
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele lényegében megszüntette a neutrofilek szabadgyök-termelését, degranulációját és szétterülését, míg külön-külön egyik antitestnek sem volt jelentős hatása.
Fenti kísérleteinket összefoglalva elmondhatjuk, hogy egér neutrofilek immobilizált immunkomplexek általi aktiválódásában elengedhetetlen szerepe van az FcγRIII és FcγRIV fehérjéknek, de a két fehérje jelentősen átfedő funkcióval rendelkezik és nagyrészt képesek a másik hiányának vagy inaktiválásának a hatását kompenzálni.
További, itt nem bemutatott kísérleteinkben megvizsgáltuk humán neutrofilek hasonló körülmények között létrejövő aktiválódásának a mechanizmusát, különösen mivel a humán neutrofilek az egér neutrofilektől jelentősen eltérő Fc-receptorokat expresszálnak (nincs rajtuk jelen FcγRIV, de expresszálnak két speciális másik Fcγ-receptort, a receptor ligand-kötő láncában ITAM-et hordozó FcγRIIA-t és a GPI-horgonnyal a plazmamembránhoz kötődő FcγRIIIB-t). Blokkoló antitestek alkalmazásával az irodalmi adatokkal egybecsengően azt találtuk, hogy a humán neutrofilek immunkomplexek általi aktiválódásához az FcγRIIA és az FcγRIIIB egyaránt szükséges (tehát az egyik blokkolása esetén a másik lényegében nem képes a funkcionális kompenzációra) [12].
7.3.3. A PLCγ2 szerepe neutrofilek immunkomplex-indukált aktivációjában A következő kísérletekben a PLCγ2
aktiválódását és esetleges szerepét vizsgáltuk neutrofilek immunkomplex-indukált aktiválódása során. Amint az a 76. ábrán látható, az immunkomplex-felszínre helyezett neutrofilekben a PLCγ2 foszforilációja volt megfigyelhető, és ehhez a foszforilációhoz szükséges volt az Src-kinázok (Hck, Fgr és Lyn), illetve a Syk jelenléte.
További nem-publikált eredményeink szerint a neutrofilek intracelluláris Ca2+-raktárainak a depletálása az immunkomplex-kiváltotta sejtválaszok megszűnését eredményezte.
Mindezek a Ca2+-szignált létrehozni képes PLCγ2 lehetséges szerepére utaltak.
Kontroll IC Kontroll IC Kontroll IC Kontroll IC anti-FcγRII/III
75. ábra: Immobilizált IgG immunkomplex (IC) által indukált szabadgyök-termelés (A), degranuláció (B) és szétterülés (C) FcγRII/II-blokkoló és/vagy FcγRIV-blokkoló, illetve izotípus kontroll (izot. kontr.) antitesttel kezelt
vad típusú egér neutrofilekben. Publikálva: [12]
A
kDa
B
kDa
Vad típus Syk–/–
Ko ntroll IC Kontroll IC
Vad típus Src-család KO
Ko ntroll IC Kontroll IC
PLCγ2 által közvetített foszforilációja immunkomplex (IC) felszínre helyezett neutrofilekben Src-család
KO: Hck–/–Fgr–/–Lyn–/–. Publikálva: [13]
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele Ezután megvizsgáltuk, hogy hogyan változnak az immunkomplex-kiváltotta sejtválaszok PLCγ2–/– neutrofilekben. Amint az a 77. ábra A részén látható, a PLCγ2 hiánya lényegében megszüntette a neutrofilek immunkomplex-felszínen kialakuló szuperoxid-termelését. Hasonló gátlás volt megfigyelhető a zselatináz-granulumok ürülése és a sejtek szétterülése esetén is. A PLCγ2 tehát fontos funkcionális szerepet tölt be a neutrofilek Fc-receptorokon keresztüli aktiválódásában.
7.3.4. A p190RhoGAP vizsgálata az immunkomplex-indukált sejtaktivációban Utoljára megvizsgáltuk, hogy szerepet játszik-e a
p190RhoGAP a neutrofilek immunkomplex-kiváltotta sejtválaszaiban. Amint azt a 78. ábra mutatja, az immunkomplex-felszínre helyezett p190RhoGAP–/–
neutrofilek a vad típusú sejtekhez hasonló mértékben termeltek szuperoxid szabadgyököt. A p190RhoGAP teát feltételezhetően nem játszik elengedhetetlen szerepet a neutrofilek Fc-receptorokon keresztüli aktiválódásában.
7.3.5. Megbeszélés
Ebben a fejezetben az egér neutrofilek immobilizált
IgG immunkomplexeken keresztüli aktiválódásának mechanizmusát vizsgáltuk. Kísérleteink során kimutattuk, hogy az immunkomplexek által kiváltott sejtválaszokhoz elengedhetetlen két FcRγ-asszociált aktiváló hatású Fcγ-receptor, az FcγRIII és az FcγRIV (72. és 74-75.
ábra) [12]. Ezen kísérleteinkben elsőként sikerült egy IgG-függő celluláris hatást rendelnünk az újonnan leírt FcγRIV-hez. További kísérleteinkben igazoltuk, hogy az ilymódon kiváltott sejtválaszok a PLCγ2 közreműködésével jönnek létre (77. ábra) [13]. Egyelőre nem publikált előzetes eredményeink szerint az immunkomplex-indukált sejtválaszokhoz szükségesek az Src-kinázok (Hck, Fgr és Lyn) és a Syk is. Összességében tehát elmondhatjuk, hogy az egér neutrofilek immunkomplex-indukált aktivációja során feltételezhetően fontos szerepet játszik az FcγRIII és FcγRIV receptorokból kiinduló Src-család–FcRγ–Syk–PLCγ2 jelpálya.
A B C
Vad típus PLCγ2–/–
Kontroll IC Kontroll IC
Kontroll IC Kontroll IC