7. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS
7.2. Jelátviteli folyamatok vizsgálata a neutrofilek sejtvándorlása során
7.2.1. A Syk szerepének vizsgálata neutrofilek migrációja során
Mivel a β2-integrinek alapvető szerepet töltenek be a fehérvérsejteknek a gyulladás helyére vándorlásában, felmerült bennünk a lehetőség, hogy a fentiekben vizsgált jelpálya a neutrofilek β2-integrin-függő migrációs folyamataiban is részt vesz. Először megvizsgáltuk a CD18 és a Syk lokalizációját poly-RGD felszínen fMLP-val stimulált egér neutrofilekben.
Amint az az 54. ábrán látható, A Syk nagy mennyiségben halmozódott fel a véletlenszerű migrációt végző neutrofilek frontális területén (A panel) és itt ko-lokalizációt mutatott a
CD18-[1-34]
jelátviteli modell Kombinált jelátviteli
modell
53. ábra: A Syk által közvetített integrin-jelátvitel feltételezett mechanizmusai. Publikálva: [11].
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele cal (B panel). Ez a megfigyelés megerősítette azt a feltételezésünket, hogy a Syk szerepet játszhat a sejtek migrációs folyamataiban.
A Syk neutrofilek migrációjában betöltött szerepét először in vitro Transwell kísérleti rendszerben vizsgáltuk (55. ábra), ami a Boyden-féle migrációs kamra továbbfejlesztett verziójának tekinthető. Ebben a rendszerben a sejtek szuszpenzióját egy alul lyukacsos membránnal lezárt edénykébe (Transwell-betétbe) helyezzük, melyet 24-lyukú lemez kemoattraktánst tartalmazó médiummal töltött üregébe illesztünk. A sejtek a kemoattraktáns grádiensének megfelelően a pórusokon keresztül az alsó térbe vándorolnak, ahol az átvándorolt sejtek megszámlálhatók vagy számuk biokémiai módszerekkel meghatározható. A porózus membránnal lezárt edényke (insert) a kereskedelmi forgalomban
különböző pórusméretekkel kapható, és felszínét tetszőleges fehérjével lehet fedni. A következő kísérletekben rutinszerűen fibrinogénnel fedett 3 µm pórusméretű polikarbonát membránnal dolgoztunk.
Amint az a 56. ábrán látható, különböző koncentrációjú fMLP kemoattraktáns alkalmazásakor a vad típusú neutrofilek nagyszámban vándoroltak a kemoattraktáns grádiens irányába. A koncentráció-függés görbéje a G-fehérje-kapcsolt receptorokon keresztüli válaszok esetén általánosan megfigyelhető haranggöre-szerű lefutást mutatta. Az ábra A részén látható továbbá, hogy a neutrofilek vándorlása nagymértékben károsodott CD18–/– sejtekben, ami a módszer
integrin-függését igazolta. A Syk–/–
neutrofilek vizsgálatakor ugyanakkor meglepetésünkre azt találtuk, hogy a sejtek migrációja nem mutatott lényeges károsodást a vad típusú sejtekéhez képest (56. ábra B része). Bár alacsonyabb fMLP-koncentrációk mellett a migráció részlegesen csökkent, magasabb koncentrációk mellett a Syk–/–
sejtek meg a vad típusúaknál nagyobb arányban is vándoroltak át a porózus membránon. Előzetes feltételezésünkkel
A B
CD18 Syk Együtt
Syk
54. ábra: A Syk likalizációja (A) és a CD18-cal való ko-lokalizációja (B) fMLP-vel stimulált vad típusú neutrofilek poly-RGD felszínen való véletlen migrációja során. B panel publikálva: [2].
[1-34]
fMLP MIP-2 stb.
Sejtek
Átvándorolt sejtek számolása
55. ábra: A Transwell migrációs assay sémája.
B A
0 10 20 30 40 50
0 1 10
fMLP (µM) Vad típus Syk–/–
0 10 20 30 40
0 1 10
fMLP (µM)
Migrált sejtek (összes %-ában)
Vad típus CD18–/–
56. ábra: CD18–/– (A) és Syk–/– (B) neutrofilek vándorlása fMLP gradiens irányában in vitro Transwell assay-ben.
Publikálva: [2].
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele és a CD18 szerepével szemben tehát a Syk ebben a kísérleti rendszerben nem vesz jelentős mértékben részt a neutrofilek migrációjában.
A következőkben a fentitől kismértékben eltérő (8 µm átmérőjű membránnal rendelkező) kísérleti rendszerben vizsgáltuk a Syk–/– neutrofilek különböző kemoattraktánsok irányába való vándorlását. Az fMLP-kiváltotta sejtvándorlás ilyen körülmények között is a fentiekhez hasonló lefutást mutatott mind vad típusú, mind Syk–/– sejtekben [4]. Amint az a 57. ábrán látható, a Syk hiánya nem befolyásolta az LTB4 és C5a kemoattraktánsok, illetve a MIP-2 kemokin irányába történő sejvándorlást, ami megerősíti, hogy a Syk nem játszik fontos szerepet a neutrofilek irányított vándorlásában.
Dr. Barbara Walzog (Ludwig-Maximilans Universität, München, Németország) munkacsoportjával együttműködve egy további in vitro rendszerben, az ún. Zigmond-kamrában is vizsgáltuk a neutrofilek in vitro vándorlását. Ebben a kísérleti rendszerben valós időben vizsgálható a két üveglap közötti keskeny térben felépített kemoattraktáns (fMLP) grádiens hatására létrejövő irányított neutrofil-migráció. A módszer előnye, hogy egyértelműen különbséget tesz a véletlenszerű és random migráció között és kizárható a sejtek károsodott adhéziója miatti esetleges
"elveszése" a rendszerből. Amint az az 58.
ábra A részén látható, ez a migrációs rendszer is nagymértékben függ a CD18 jelenlététől, hiszen a CD18–/– neutrofilek lényegében nem mutatnak irányított vándorlást (kemotaxist). A 58. ábra B része szerint a Syk–/– neutrofilek ebben a kísérleti rendszerben kismértékű károsodást mutattak (elsősorban a migrációnak a gradiens felé való irányítottságában), de ez a károsodás nem volt összemérhető a CD18–/– neutrofilekben megfigyelhető lényegében teljes károsodással, tehát a Syk–
/– neutrofilek ebben a kísérleti felállásban is képesek voltak a CD18-függő sjetvándorlásra fMLP-grádiens jelenlétében.
B C
A
0 10 20 30 40 50 60 70
– 10 30 100 300
LTB4 (nM)
Migrált sejtek száma (összes %-ában)
Vad típus Syk–/–
0 5 10 15 20 25 30
– 10 30 100 300
C5a (ng/ml) Vad típus Syk–/–
0 5 10 15 20 25 30 35
– 100
MIP-2 (ng/ml) Vad típus Syk–/–
57. ábra: Syk–/– neutrofilek vándorlása 8 µm átmérőjű membránon keresztül LTB4 (A), C5a (B) és MIP-2 (C) hatására. Publikálva: [4].
fMLP-grádiens A
B Vad típus Syk–/–
Vad típus CD18–/–
58. ábra: CD18–/– (A) és Syk–/– (B) neutrofilek vándorlása fMLP gradiens irányában in vitro
Zigmond-kamrában. Publikálva: [10].
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele Bár a fenti eredmények egyöntetűen arra utaltak, hogy a Syk-nek nincs megkerülhetetlen szerepe a neutrofilek integrin-függő in
vitro sejtvándorlásában, szerettük volna a kérdést in vivo körülmények között is megvizsgálni. Ehhez a neutrofilek in vivo migrációjának egyik legelterjedtebb modell-rendszerét, a tioglikollát-indukált peritonitis-modellt használtuk fel. A módszer során tioglikollát intraperitoneális injekciójával steril peritonitist hozunk létre, melynek hatására órákon belül nagyszámú neutrofil vándorol a peritoneumba (59.
ábra), míg a mononukleáris sejtek (pl. makrofágok) felszaporodása ekkor (az első 4 órában) még nem jellemző (utóbbi sejtek felszaporodása 4 óra után kezdődik és 24 óra után maximális).
Az in vivo kísérletek során fontosnak tartottuk, hogy kizárjuk a különböző knockout egerek eltérő immunológiai és egyéb státuszából eredő másodlagos hatásokat, ezért beállítottunk egy olyan kísérleti rendszert, melyben a vad típusú és mutáns sejteket egy egyeden belül, azonos körülmények között hasonlíthatjuk össze. Ennek érdekében CD45.1 markert hordozó vad típusú és CD45.2 markert hordozó knockout hemopoetikus (magzati máj vagy csontvelői) sejteket
összekevertünk, és ezzel a kevert donor-populációval végeztünk transzplantációt CD45.1-et hordozó vad típusú recipiensekbe (60. ábra). Az így létrehozott kevert csontvelői kimérák perifériás vérében (vagy bármely más testfolyadékában) áramlási citometriával egyértelműen el tudtuk különíteni a vad típusú (CD45.2-negatív) és a knockout (CD45.2-pozitív) sejteket (60. ábra).
A fenti módon létrehozott kevert csontvelői kimérákban tioglikolláttal peritonitist váltottunk ki és megvizsgáltuk a vad típusú és a mutáns neutrofilek megoszlását a perifériás vérben, illetve a peritoneális folyadékban. A kapott értékeket a 61. ábrán bemutatottnak
Fokozott (>2) Normális (0.5 – 2) Csökkent (<0.5)
knockout PMN-ek aránya a vérben )
vad típusú PMN-ek aránya a peritoneumban vad típusú PMN-ek aránya a vérben )
Knockout PMN-ek relatív migrációja:
relatív migráció =
(
Knockout (CD45.2) : Vad típus (CD45.1) kevert csontvelő-kimérák
knockout PMN-ek aránya a peritoneumban
(
Knockout PMN aránya a vérben (összes PMN %-ában) Knockout PMN aránya a peritoneumban (összes PMN %-ában)
61. ábra: Tioglikollát-indukált peritonitis vizsgálata kevert csontvelői kimérákban.
Vad
60. ábra: Kevert csontvelő-kimérák létrehozása és vizsgálata. A jobb oldali áramlási citometriás kép egy kevert kiméra perifériás vérében található neutrofilek
(Gr1-pozitív sejtek) megoszlását mutatja.
0 Sejtek száma a peritoneumban (106/egér)
Neutrofilek Mononukl. sejtek
59. ábra: Neutrofilek és mononukleáris sejtek megjelenése tioglikollát-indukált peritonitis során.
Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele megfelelő koordináta-rendszerben ábrázoltuk. Amennyiben az adott mutáció nem befolyásolta volna a sejtek vándorlási képességét, akkor a vérben és a peritoneumban hasonló arányban vártuk volna a mutáns neutrofilek arányát. Amennyiben a mutáció gátolta volna a migrációt, a peritoneumban a mutáns neutrofilek kisebb arányban lettek volna jelen, mint a vérben. Amennyiben pedig a mutáció fokozta volna a migrációt, a peritoneumban a vérnél nagyobb arányban vártunk volna mutáns neutrofileket. Ezeket a lehetőségeket a 61.
ábrán különböző színekkel jelöltem. A kapott eredményekből a 61. ábrán bemutatott képlet alapján számszerűsítettük is a mutáns neutrofilek relatív migrációs képességét a referenciaként használt CD45.1-et expresszáló vad típusú sejtekhez képest.
A fenti in vivo rendszer segítségével először megvizsgáltuk a CD18 szerepét a neutrofilek sejtvándorlásában tioglikollát-indukált peritonitis során. Amint az a 62. ábra A paneljén látható, a CD18–/– neutrofilek aránya mindegyik vizsgált kevert kimérában lényegesen alacsonyabb volt a peritoneális folyadékban, mint a vérben, ami arra utalt, hogy CD18 hiányában a neutrofilek lényegesen rosszabb hatásfokkal tudtak a peritoneumba vándorolni. Ennek megfelelően a CD18–/– neutrofilek relatív migrációs kapacitása lényegesen alacsonyabb volt, mint a vad típusú sejteké (62. ábra C része). Ezen kísérletek megerősítették az alkalmazott kísérleti rendszer integrinektől való függését.
A kísérleti rendszer beállítása és általános jellemzése után megvizsgáltuk a Syk szerepét is a neutrofilek in vivo vándorlásában. Ezen kísérleteink azt mutatták, hogy a Syk–/–
neutrofilek aránya a peritoneumban minden vizsgált kevert kimérában összevethető, sőt kissé magasabb is volt, mint ugyanezen sejtek aránya a vérben (62. ábra B része). Ennek megfelelően a Syk–/– neutrofilek relatív migrációs kapacitása a vad típusú sejtek kb.
kétszeresének adódott (62. ábra C része). A Syk tehát in vivo sem szükséges a neutrofilek integrin-függő migrációjához, sőt a Syk hiánya kismértékben fokozza is a neutrofileknek a gyulladás helyére történő vándorlását.