A Syk szerepének vizsgálata neutrofilek integrin-jelátvitelében

A következőkben megvizsgáltuk a neutrofileknek a 21. ábrán bemutatott módszerrel kiváltott adherens aktivációját Syk^–/– csontvelő-kimérákból származó sejteken. Amint azt a 25. ábra mutatja, fibrinogén-felszínre helyezett Syk^–/– neutrofilekben lényegében teljesen elmaradt a sejtek TNF-indukált szabadgyök-termelése, a szekunder granulum marker laktoferrin ürítése, illetve a sejtek szétterülése. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a Syk fontos szerepet játszik a neutrofilek adherens aktiválódásában.

Ezután azt szerettük volna megvizsgálni, hogy az adherens aktiváció Syk^–/–

neutrofilekben megfigyelt károsodása specifikus-e az alkalmazott TNF stimulusra, illetve a fibrinogén felszínre. Ennek érdekében megvizsgáltuk a Syk^–/– neutrofilek szabadgyök-termelését egyéb szolubilis stumulusok, illetve más integrin-ligand felszínek jelenlétében.

Amint az a 26. ábra A részén látható, a fibrinogén-fedett felszínre helyezett Syk^–/– neutrofilek a bakteriális tripeptid fMLP, a MIP-2 kemokin (a humán IL-8 rokona), illetve az LPS hatására sem termeltek szuperoxidot. A 26. ábra B-C része pedig azt mutatja, hogy a TNF-indukált szabadgyök-termelés kollagénnel, FCS-sel és rekombináns ICAM-1-gyel fedett felszínen is Syk-függőnek bizonyult. A Syk szerepe a neutrofilek adherens aktivációjában tehát nem korlátozódik a rutinszerűen alkalmazott TNF citokinre és fibrinogén felszínre.

Kontroll TNF

A

Syk–/–Vad típus

C B

-0.5 0 0.5 1 1.5 2

0 20 40 60

Idő (perc)

Szuperoxid-termelés (nmol/1E6 sejt)

Vad típus Kontroll Vad típus TNF Syk–/– Kontroll Syk–/– TNF

0 2 4 6

Vad típus

Syk–/–

Laktoferrin-ürítés (ng/1E6 sejt/60')

Kontroll TNF

25. ábra: A Syk szerepe egér neutrofilek fibrinogén felszínen TNF hatására való aktivációjában. Publikálva: [2].

Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele

A fenti megfigyelések magyarázatára számos lehetőség adódik. A legegyszerűbb magyarázat az lenne, ha a Syk hiánya a neutrofilek általános fejlődési vagy működési zavarát eredményezné. A fejlődési zavar lehetőségének ellentmond a Syk^–/– neutrofilek látszólag normális érése, száma és a sejtfelszíni markerek normális expressziója [2]. A sejtek általános válaszképességét a PKC-aktiváló PMA általi sejtaktiváció során vizsgáltuk. A PMA a neutrofilek nem-fiziológiás aktivációját hozza létre, melynek hatására nagymértékű szabadgyök-termelés és degranuláció jön létre a β₂-integrinektől független módon [2]. Amint az a 27. ábrán látható, Syk^–/– neutrofilekben nem károsodott a PMA-kiváltotta szuperoxid-termelés és degranuláció, és a Syk^–/– sejtek képesek voltak szétterülni a fibrinogénnel fedett felszínen. A Syk hiánya tehát nem okozza a neutrofilek válaszképességének általános zavarát. További lehetőség az alkalmazott szolubilis gyulladásos agonisták által kiváltott jelátvitel zavara. Ennek részben ellentmondanak a 25-26. ábrán bemutatott kísérletek, melyek szerint a Syk^–/– neutrofilekben számos, teljesen különböző jelátvitelt alkalmazó receptoron (citokin-receptorok, G-fehérje-kapcsolt receptorok, Toll-szerű receptorok) keresztül ható szolubilis agonista alkalmazásakor is az adherens aktiváció teljes károsodása volt megfigyelhető. A kérdés pontosabb vizsgálata érdekében megvizsgáltuk azonban a TNF által adhézió-független módon kiváltódó sejtválaszokat is. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy az L-szelektinek TNF-kiváltotta vedlése és a CD18-expresszió TNF hatására létrejövő fokozódása (mindkettő független a sejtek adhéziójától) nem károsodott a Syk^–/– sejtekben [2].

A G-fehérje-kapcsolt receptorok (pl. az fMLP és a MIP-2 receptora) jelátvitelének részletes vizsgálata során szintén arra a következtetésre jutottunk, hogy a Syk nem vesz részt ezen receptorok jelátviteli folyamataiban [4] (részletesen ld. a dolgozat későbbi részében). Joggal feltételezhetjük tehát, hogy az adherens aktiváció Syk^–/– neutrofilekben megfigyelt zavara nem az alkalmazott szolubilis agonisták által kiváltott jelátvitel zavara miatt jön létre.

Kontroll

27. ábra: PMA-kiváltotta sejtválaszok Syk^–/– neutrofilekben. Publikálva: [2].

A B C

26. ábra: A Syk szerepének vizsgálata neutrofilek adherens aktivációjában egyéb stimulusok és integrin-ligand felszínek jelenlétében. Publikálva: [2].

Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele A fentiek alapján a legvalószínűbb magyarázat az adherens aktivációnak a Syk^–/–

neutrofilekben megfigyelhető károsodására a Syk-nek az integrinek jelátvitelében betöltött szerepe. Ezt egy mesterségesen létrehozott polivalens

integrin-ligand, a poly-RGD segítségével közvetlenül is megvizsgáltuk. Amint az a 28. ábrán látható, poly-RGD felszínre helyezve a vad típusú neutrofilek szolubilis stimulus hozzáadása nélkül is jelentős szabadgyök-termeléssel válaszolnak, és ez a válasz jelentősen károsodott a CD18 genetikai hiányában. Ez a kísérleti rendszer tehát szolubilis agonista alkalmazása nélkül is alkalmas a β2-integrin-függő neutrofil-válaszok vizsgálatára.

Amint a 28. ábráról leolvasható, a Syk^–/– neutrofilek poly-RGD felszínen is jelentős funkcionális károsodást mutattak, ami további érvet szolgáltat a Syk-nek az integrinek jelátvitelében betöltött szerepéhez.

A következő kísérletekben biokémiai módszerekkel vizsgáltuk a Syk adhézió-függő aktiválódásának a mechanizmusát neutrofilekben. Amint az a 29. ábra A részén látható, poly-RGD (pRGD) felszínre helyezett vad típusú neutrofilekben létrejön a Syk foszforilációja és ez a foszforiláció csaknem teljesen hiányzik CD18^–/– sejtekben.

Ez megerősíti a Syk integrin-függő aktiválódását poly-RGD felszínen. A 29. ábra B részén az látható, hogy a poly-RGD felszínen létrejövő Syk-foszforiláció teljesen megszűnt olyan sejtekben, melyekből genetikailag hiányzik a mieloid sejtekre jellemző három Src-típusú tirozin-kináz, a Hck, az Fgr és a Lyn (Src-család KO). A Syk β2-integrin-függő aktiválódása tehát feltételezhetően az Src-kinázok közreműködésével valósul meg.

A következő kísérletek során a Syk által adherens körülmények között aktiválódó ("downstream") jelpályák egyes elemeit próbáltuk azonosítani. Ennek érdekében vad típusú és Syk^–/– neutrofileket poly-RGD-vel fedett felszínre helyezve aktiváltuk a sejteket, és biokémiai módszerekkel vizsgáltuk a különböző jelátvivő fehérjék foszforilációját és aktivitását. Amint az a 30. ábra A részén bemutatott teljes foszfotirozin immunoblottokon látható, poly-RGD hatására vad típusú neutrofilekben számos fehérje foszforilálódik, melyek közül a legmarkánsabb szignál 45, 65, 95-130 és 150 kDa közeli magasságokban található.

Ezen fehérjék mindegyikének a foszforilációja jelentős mértékben csökkent Syk^–/–, CD18^–/–

és Hck^–/–Fgr^–/–Lyn^–/– (Src-család KO) sejtekben.

-0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

0 20 40 60

Idő (perc) Szuperoxid-termelés (nmol/1E6 sejt) Vad típus

Syk–/–

CD18–/–

28. ábra: Szuperoxid-termelés poly-RGD felszínen. Publikálva: [2].

Src-család KO Vad típus

Szuszp pRGD

CD18^–/–

Szuszp pRGD

A

PY WB Syk WB Syk

IP

B ^{Vad típus}

Szuszp pRGD Szuszp pRGD PY

Syk WB IP Syk

WB

29. ábra: A CD18 és az Src-kinázok szerepe a Syk aktiválódásában.

pRGD: poly-RGD; Src-család KO:

Hck^–/–Fgr^–/–Lyn^–/–; IP:

immunprecipitáció; PY: foszforitozin;

WB: Western Blot. Publikálva: [2].

Dr. Mócsai Attila Hemopoetikus sejtek jelátvitele

A 45 kDa magasságban található egyik lehetséges fehérje a p38 MAP-kináz. Ezért megvizsgáltuk a p38 MAP-kináz jelpálya aktiválódását Syk^–/– neutrofilekben. Amint az a 30.

ábra B-C részén látható, vad típusú sejtekben létrejött mind a p38 MAP-kináz foszforilációja, mind az attól disztálisan elhelyezkedő MAPKAPK2 aktiválódása, míg Syk^–/– sejtekben egyik válasz sem volt megfigyelhető. A 95-130 kDa tartományban számos lehetséges jelátvivő molekula helyezkedik el. Ezek közül a Cbl, a Pyk2 és a Vav foszforilációját mutatja a 30.

ábra D-F része. Ezen kísérletek azt mutatják, hogy vad típusú sejtekben mindhárom fehérje foszforilálódik poly-RGD hatására, míg Syk^–/– sejtekben ezen foszforilációs válaszok nagyrészt elmaradnak. A 150 kDa magasságban található csík feltételezésünk szerint a PLCγ2. Ennek a fehérjének a szerepéről dolgozatom további részében részletesen beszámolok.

7.1.4. ITAM-tartalmú adapter-fehérjék szerepe a β2-integrinek jelátvitelében