MEGHATÁROZÁSÁHOZ
2. Anyag és módszer 1 Mintaelőkészítés
Fenol-kloroform-izoamil-alkoholos módszerrel (De és mtsai, 2011) nyertük ki a DNS-t 70 mg házigalamb mellizomból. A DNS koncentrációját, illetve minősé-gét NanoDrop 1000 spektrofotométer segítségével ellenőriztük (Thermo Fischer Scientific, USA).
2.2 Primer tervezés
A házigalamb (génbank azonosító: FN675581.1) 12S rRNS mitokondriális DNS szekvenciáját az NCBI GenBank adatbázisáról töltöttük le, melyet a CLUSTAL OMEGA algoritmus (Európai Bioinformatikai Intézet (EBI)) segítségével más
szárnyas fajok DNS-ével összevetettük. A munkacsoportunk által korábban ter-vezett univerzális primerpárt használtuk (Csikos és mtsai), mely a különböző baromfi fajok 12S rRNS régióját egyidejűleg képes felszaporítani. A házigalamb esetében a PCR termékméret 285 bázispár. A primereket Oligoanalyzer szoftver (Integrated DNA Technologies, Inc.) segítségével ellenőriztük.
2.3 Polimeráz láncreakció
A kapilláris elektroforézis módszer kivitelezéséhez a primereket fluorescensen kellett jelölnünk (Life Technologies). A forward primert 5’-végen 6-karboxifluoresceinnel (6-FAM), a reverz primert 5’-végen VIC-kel jelöltük. A polimeráz láncreakciót a házigalamb DNS-ének amplifikálására 30 µl végtérfo-gatú elegyben hajtottuk végre, amely az alábbi összetételű volt: 1x Dream Taq puffer (Fermentas), 200 µM dNTP mix (Fermentas), 4 mM MgCl2 (Promega),
0,1 µM 6-FAM jelölt forward primer (Sigma-Aldrich), 0,1 µM VIC jelölt reverz primer (Sigma-Aldrich), 1,5 U Dream Taq polimeráz (Fermentas) és 150 ng DNS templát. A reakciót PTC-200 (Bio-Rad, USA) típusú PCR-el végeztük.
Az amplifikáció lépései: hőmérséklet denaturáció 95°C-on 1,5 perc, 35 ciklus-ban denaturáció 95°C-on 30 másodperc, primer tapadás 60°C-on 30 másodperc, szintézis 72°C-on 30 másodperc. A végső szintézis lépés 5 perc 72°C. A felszapo-rított PCR termékeket etídium-bromid festéssel (Bio-Rad, USA) tettük láthatóvá, majd 2 m/v% agaróz gélen (Lonza) 1h-án keresztül, TAE (Tris-Acetát-EDTA, pH:8) (Lonza) pufferben, 10 V/cm-es feszültséggel ellenőriztük.
2.4 Mintaelőkészítés és a kapilláris elektroforézis – egyszálú konformációs DNS polimorfizmus (CE-SSCP) kivitelezése
A kapilláris elektroforézist ABI Prism 310 Genetic Analyzeren (Life Technologies) végeztük, mely argon-ion lézer segítségével detektálja a minta fluorescenciáját (488 – 514 nm). A mintát elektro-kinetikus befecskendezéssel 15 kV-on juttattuk a ka-pillárisba (Life Technologies), mely effektív hossza 30 cm. A kapillárist 15 m/v%
Pluronic F108 polimer oldattal (Sigma-Aldrich) töltöttük fel, mely 0,7x Genetic Analyzer puffert (Life Technologies) is tartalmaz. Az elektroforézis körülményeit az optimalizáció során állítottuk be. A fluorescens jelet 525-650 nm közötti hullámhossz tartományban detektáltuk. Adatainkat a Data Collection Software 3.1.0-ás program verziójával készítettük, melyek kiértékelése a GeneMapper® 3.7 (Life Technologies) szoftver segítségével történt. A futtatások során az elektroferogrammok közötti kü-lönbségeket GeneScanTM 500 LIZTM Size Standard (Life Technologies) segítségével küszöböltük ki. A minta előkészítése az alábbi módon történt: 0,5 µl PCR terméket 0,5 µl 500 LIZTM festékkel, illetve 9 µl Hi-Di formamiddal (Life Technologies) ke-vertük, majd az elegyet 95°C-on 3 percig denaturáltuk. A denaturációt követően a mintát közvetlenül jégre tettük a további felhasználásig. Az egyszálúsított galamb
DNS molekula mintázatát a futtatási paraméterek optimalizálásával határoztuk meg.
Beállított paramétereink: elektroforézis feszültség, elektroforézis idő, futtatási hő-mérséklet, elektrokinetikus befecskendezési idő.
3. Eredmények
3.1 Elektroforézis feszültsége
Az elektroforézis feszültsége a futtatás sebességét befolyásolja. Alacsony feszültség esetén a kapillárisban a minta haladási sebessége alacsony, magas feszültség ese-tén gyorsan halad a DNS, konstans 35 perc futtatási idő függvényében. Kísérleti rendszerünkben 5kV feszültség esetén 35 perc futtatási időnél nem figyeltünk meg DNS mintázatot, 10 kV feszültségnél a primer csúcsok, illetve puffer front jelenlé-tét tapasztaltuk. 15 kV feszültség esetében a specifikus fajra jellemző, 6-FAM jelölt forward, illetve VIC jelölt reverz DNS szálakat detektálni tudtuk (1. ábra).
RFU
A
Futtatási feszültség: 10 kV
adatpontok puffer front
primer csúcsok
RFU
B
Futtatási feszültség: 15 kV
adatpontok puffer front
primer csúcsok LIZ 500 DNS molekula marker
6-FAM jelölt forward szál
VIC jelölt reverz szál
1. ábra: Az eletroforézis feszültségének hatása a házigalamb DNS mintázatára Elektroferogrammok: 10 kV (A), illetve 15 kV (B) futtatási feszültség esetén.
RFU=relatív fluorescencia egység; adatpontok (1 adatpont 220 ms időnek felel meg).
3.2 Migrációs idő
A migrációs idő beállítása a futtatás feszültségének függvényében történik. 15 kV futtatási feszültség esetén az optimális idő 35 perc volt, mely esetben a speci-fikus fluorescens jelölt csúcsok jelenlétét tapasztaltuk (2. ábra).
RFU A
Migráció ideje: 60 perc
adatpontok LIZ 500 DNS molekula marker
6-FAM jelölt forward szál
VIC jelölt reverz szál
RFU
B
Migráció ideje: 35 perc
adatpontok
LIZ 500 DNS molekula marker
6-FAM jelölt forward szál
VIC jelölt reverz szál
2. ábra: Az eletroforézis migráció idejének hatása a házigalamb DNS mintázatára Elektroferogrammok: 60 perc (A), illetve 35 perc (B) migrációs idő esetén.
RFU=relatív fluorescencia egység; adatpontok (1 adatpont 220 ms időnek felel meg).
3.3 Elektroforézis hőmérséklete
Az elektroforézis hőmérsékletének beállítása kritikus pont, mivel a DNS egyszálúsítást követően a szálak a hőmérséklet függvényében vesznek fel alak-zatot. 45°C, illetve 60°C hőmérséklet esetén nem jelentek meg konformerek.
35°C-nál kialakultak a galambra jellemző stabil 6-FAM és VIC jelölt konformerek (3. ábra).
RFU
AElektroforézis hőmérséklete: 45°C
adatpontok
LIZ 500 DNS molekula marker
BElektroforézis hőmérséklete: 60°C
adatpontok
RFU
LIZ 500 DNS molekula marker
C
Elektroforézis hőmérséklete: 35°C
adatpontok
RFU
LIZ 500 DNS molekula marker
6-FAM jelölt forward szál
VIC jelölt reverz szál
3. ábra: Az eletroforézis futtatási hőmérsékletének hatása a házigalamb DNS mintázatára
Elektroferogrammok: 45°C (A), 60°C (B), illetve 35°C (C) futtatási hőmérséklet esetén.
RFU=relatív fluorescencia egység; adatpontok (1 adatpont 220 ms időnek felel meg).
3.4 Befecskendezési idő
A befecskendezési idő beállításával az elektroferogrammok sávmintázatának in-tenzitását szabályozhatjuk. A befecskendezési idő növelése, illetve csökkentése az összes sáv intenzitásának emelkedését, illetve csökkenését okozza. Kísérleti rendszerünkben 10 másodperc befecskendezési időt állapítottunk meg optimá-lisnak. Az elektroferogrammokon a galamb mintázatra jellemző fluorescensen jelölt csúcsok tartománya van feltüntetve (4. ábra).
ABefecskendezési idő: 5 másodperc
adatpontok
RFU
LIZ 500 DNS molekula marker 6-FAM jelölt
forward szál
VIC jelölt reverz szál
BBefecskendezési idő: 10 másodperc
adatpontok
RFU
LIZ 500 DNS molekula marker 6-FAM jelölt
forward szál
VIC jelölt reverz szál
C
Befecskendezési idő: 20 másodperc
adatpontok
RFU
LIZ 500 DNS molekula marker
6-FAM jelölt forward szál
VIC jelölt reverz szál
4. ábra: A minta befecskendezési idejének hatása a házigalamb DNS mintázatára Elektroferogrammok: 5 másodperc (A), 10 másodperc (B), illetve 20 másodperc (C) befecskendezési idő esetén. RFU=relatív fluorescencia egység; adatpontok (1 adatpont 220 ms időnek felel meg). A befecskendezési idő egyidejűleg változtatja az összes sáv intenzitását.
3.5 Minta koncentrációja
A minta DNS koncentrációja a specifikus, jelölt konformerek intenzitását befo-lyásolja. A koncentráció emelkedésével a jelölt sávok jelerőssége nő a rendszer többi komponensével szemben. Az elektroferogrammokon a galamb mintázatra
jellemző fluorescensen jelölt csúcsok tartománya van feltüntetve (5. ábra).
A
Minta koncentrációja: 50 ng/µl DNS
adatpontok
RFU
LIZ 500 DNS molekula marker
6-FAM jelölt forward szál
VIC jelölt reverz szál
B
Minta koncentrációja: 50 ng/µl DNS
adatpontok
RFU
LIZ 500 DNS molekula marker
6-FAM jelölt forward szál
VIC jelölt reverz szál
C
Minta koncentrációja: 200 ng/µl DNS
adatpontok
RFU
LIZ 500 DNS molekula marker
6-FAM jelölt
forward szál VIC jelölt
reverz szál
5. ábra: A minta koncentrációjának hatása a házigalamb DNS mintázatára Elektroferogrammok: 50 ng/µl (A), 100 ng/µl (B), illetve 200 ng/µl DNS (C) kon-centráció esetén. RFU=relatív fluorescencia egység; adatpontok (1 adatpont 220 ms időnek felel meg). A koncentráció növekedésével a fluorescensen jelölt sávok intenzitása nő, a többi csúcs intenzitása csökken.
4. Diszkusszió
Kísérleteink során olyan kapilláris elektroforézis – egyszálú konformációs DNS polimorfizmus rendszert állítottunk be, mely segítségével a házigalamb (Columba livia domestica) DNS mintázatát meghatároztuk. A meghatározásban kritikus
fak-torok a futtatási feszültség, migrációs idő, hőmérséklet, pH (Ren, 2000; Kourkine és mtsai, 2002). Lépésről lépésre a különböző szempontok szerint vizsgáltuk a futtatási mintázatot és a megfelelő beállítás megtalálásával dolgoztunk tovább.
A futtatási feszültség esetén 15 kV-ot állapítottunk meg optimálisnak. Ez a fe-szültség érték elég magas ahhoz, hogy rövid migrációs idő alatt végbe menjen a futtatás, illetve a sávmintázatok minősége is értékelhető (1. ábra). A migrációs idő megválasztása során figyelembe vettük, hogy a PCR termék milyen futtatási mintázattal rendelkezik, ugyanis alacsony futtatási idő esetében a galamb DNS-re jellemző fluoDNS-rescensen jelölt szálak nem jelentek meg, magas esetén túlléptük a vizsgálati tartományt (2. ábra). A futtatási hőmérséklet beállítása során három hőmérsékleti tartományt fedtünk le. 45, illetve 65°C esetén nem jelentek meg stabil konformerek, 35°C tartományban a galamb DNS mintázat volt megfigyelhető (3.
ábra). A minta befecskendezési idejét 10 másodpercben állapítottuk meg, melynél a sávintenzitás magas, illetve a zaj alacsony volt (4. ábra). A DNS mennyisége 50 ng volt, mely PCR termékét használtuk fel a CE-SSCP analízishez, ahol a reakció-elegyben a PCR termék mennyiségét növelve, illetve csökkentve szabályoztuk a DNS koncentrációját, ilyen módon a jelölt szálak sávintentitását is (5. ábra).
Összefoglalva a házigalambra jellemző DNS mintázatot az alábbi beállítások al-kalmazásával kaptuk meg: 15 kV futtatási feszültség, 35 perc migrációs idő, 35°C futtatási hőmérséklet, 10 másodperc befecskendezési idő (6. ábra). Esetünkben a 6-FAM jelölt kék, illetve VIC jelölt zöld DNS szálakból egy-egy alakult ki, ami alapján elmondható, hogy a házigalamb forward és reverz szálai egyedi konformá-ciót vesznek fel. Luo és mtsai (2003) restrikciós enzimmel emésztett mesterséges baktérium kromoszóma fragmenseket jelöltek fluorescens festékekkel, esetükben az elektroferogrammokon négy különböző jelölt csúcs jelent meg, a négy restrikciós hasítás következtében. Haunshi és mtsai (2009) fajspecifikus PCR-ral, Jonker és mtsai (2008) valós idejű PCR-ral azonosították a házigalamb DNS-t. Marrero és mtsai (2008) PCR-RFLP módszerrel két galamb populáció azonosítását végezték el.
A PCR-CE módszer előnyei a többi PCR alapú eljárással szemben, hogy gyors, automatizálható, nagy felbontóképességű és környezetkímélő.
5. következtetések
Kapilláris elektroforézis – egyszálú konformációs DNS polimorfizmus módszer alkalmazásával meghatároztuk a házigalamb (Columba livia domestica) DNS mintázatát. A jövőben tervezzük a tenyésztett baromfi fajok egyedi DNS min-tázatának meghatározását CE-SSCP módszerrel. Az optimalizálást követően a kereskedelmi forgalomban lévő, baromfihúsból készített élelmiszerek vizsgálatát tűztük ki célul.
köszönetnyilvánítás
Köszönetnyilvánítás: A munkát a TÁMOP-4.1.1.C-12/1/KONV-2012-0014 pro-jekt, Magyar ország támogatta.
Irodalomjegyzék
Csikos, A., Hodzic, A., Pasic-Juhas, E., Javor, A., Hrković-Porobija, A., Goletic, T., Gulyas, G., & Czegledi, L. : Applicability and sensitivity of PCR SSCP method for milk species identification in cheese. Acta Alimentaria. (Accepted manuscript; In press)
Dalmasso, A., Fontanella, E., Piatti, P., Civera, T., Rosati, S., & Bottero, M.
(2004): A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Molecular and Cellular Probes, 18(2), 81-87.
De, S., Brahma, B., Polley, S., Mukherjee, A., Banerjee, D., Gohaina, M., Singh, K. P., Singh, R., Datta, T. K., & Goswami, S. L. (2011): Simplex and duplex PCR assays for species specific identification of cattle and buffalo milk and cheese. Food Control, 22(5), 690-696.
Haunshi, S., Basumatary R., Girish P., Doley S., Bardoloi R., & Kumar A.
(2009): Identification of chicken, duck, pigeon and pig meat by species-specific markers of mitochondrial origin. Meat Science, 83(3), 454-459.
Jonker, K., Tilburg J., Hägele G., & De Boer E. (2008): Species identification in meat products using real-time PCR. Food Additives and Contaminants, 25(5), 527-533.
Kocher, T. D., Thomas, W. K., Meyer, A., Edwards, S. V., Paabo, S., Villablanca, F. X., & Wilson, A. C. (1989): Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86(16), 6196-6200.
Kourkine, I. V., Hestekin, C. N., & Barron, A. E. (2002): Technical challenges in applying capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism for routine genetic analysis. Electrophoresis, 23(10), 1375-1385.
Luo, M., Thomas C., you F. M., Hsiao J., Ouyang S., Buell C. R., Malandro
M., McGuire P. E., Anderson O. D., & Dvorak J. (2003): High-throughput fingerprinting of bacterial artificial chromosomes using the snapshot labeling kit and sizing of restriction fragments by capillary electrophoresis. Genomic, 82(3), 378-389.
Mane, B. G., Tanwar, V. K., Girish, P. S., & Dixit, V. P. (2006): Identification of species origin of meat by RAPD–PCR technique. Journal of Veterinary Public Health, 4, 87-90.
Marrero, P., Cabrera V. M., Padilla D. P., & Nogales M. (2008): Molecular identification of two threatened pigeon species (Columbidae) using faecal samples. Ibis, 150(4), 820-823.
Orita, M., Suzuki, y., Sekiya, T., & Hayashi, K. (1989): Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics, 5(4), 874-879.
Rabilloud, T., & Lelong C. (2011): Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: a tutorial. Journal of Proteomics, 74(10), 1829-1841.
Ren, J. (2000): High-throughput single-strand conformation polymorphism analysis by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 741(2), 115-128.
Rodríguez-Ramírez, R., González-Córdova, A. F., & Vallejo-Cordoba, B.
(2011): Review: Authentication and traceability of foods from animal origin by polymerase chain reaction-based capillary electrophoresis. Analytica Chimica Acta, 685(2), 120-126.
Skarpeid, H. J., Kvaal, K., & Hildrum, K. I. (1998): Identification of animal spe-cies in ground meat mixtures by multivariate analysis of isoelectric focusing protein profiles. Electrophoresis, 19, 3103-3109.
Lektorálta: Prof. Dr. Kovács András, Debreceni Egyetem Mezőgazdaság-, élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, egyetemi tanár