A Phytophthora-fajok detektálásának és azonosításának molekuláris módszerei

A leggyakoribb DNS alapú tesztek PCR (polymerase chain reaction) amplifikáció felhasználásával dolgoznak. A PCR technológia alkalmazásának legnagyobb előnye a hagyományos technológiákkal szemben a gyorsaságuk és a sokoldalúságuk (COOKE és mtsai 2007). A gyorsaságból adódó lehetőségeket használják ki a Phytophthora ramorum esetében már kifejlesztett terepi PCR technikák is (O'BRIEN

és mtsai 2009). Fajspecifikus primerek azonban más Phytophthora fajok – P.

parasitica, P. citrophthora, P. alni – esetében is rendelkezésre állnak. Ezek nagy előnye, hogy csak a célzott Phytophthora faj genomjába képesek bekötni. Egy adott faj kimutatását akár fertőzött növényi szövetből vagy a felhasznált levélcsapdából is képesek kimutatni (ÉRSEK és mtsai 1994, BAKONYI és mtsai 2006).

Jelenleg kórokozók detektálására és azonosítására a PCR az elérhető legfontosabb és legérzékenyebb technológia (COOKE és mtsai 2007), bár alkalmazása során kérdések és problémák is felmerülhetnek. Növényi szövetből vagy talajból történő közvetlen detektálás esetén pl. a PCR hatékonysága két-három nagyságrenddel is csökkenhet a jelenlévő inhibitorok (lignin, egyéb szénhidrátok, humuszsavak, fenolok, gyanta…) miatt, a micélium felhasználásához képest. Ezekben a különleges esetekben, érzékeny és pontos detektálás kivitelezéséhez célszerű speciális kit-eket alkalmazni, vagy a PCR kémiáján változtatni (DMSO vagy glicerin hozzáadása, kevésbé érzékeny polimeráz választása) (O'BRIEN és mtsai 2009).

Az érzékenység növelésére az ún. nested PCR eljárás is alkalmas (O'BRIEN és mtsai 2009). Ennek során, két primer párt alkalmaznak: az első pár által kijelölt amplikonon belül jelöl ki egy kisebb DNS szakaszt a második felhasznált primer pár.

Hátránya, hogy több időt igényel és megnöveli a hamis pozitívok arányát (COOKE és mtsai 2007).

32

A hagyományos PCR technikák közé tartozik a Multiplex PCR is. Ennek során több primer pár alkalmazásával, egyidejűleg több kórokozó detektálása is lehetséges (COOKE és mtsai 2007). Bár a reakció érzékenysége csökken (O'BRIEN és mtsai 2009), idő-és költséghatékonysága nő.

Az ún. Real-time PCR eljárás nagy előnyei a hagyományos PCR technikákhoz képest, hogy gyorsabb, és nem teszi szükségessé a gélelektroforézis alkalmazását, így automatizálható eljárást biztosít (COOKE és mtsai 2007; O'BRIEN és mtsai 2009).

Diagnisztikai laborokban jelenleg az egyik leggyakoribb eljárás kórokozók detektálására (O'BRIEN és mtsai 2009). A real-tme PCR mindkét kémiája (SYBR Green és TaqMan) alkalmazható Phytophthora fajok esetében. Környezeti minták elemzéséhez a módszer tovább fejleszthető, több primer pár egyidejű alkalmazásával (multiplex real-time PCR). A real-real-time PCR további nagy előnye, hogy érzékenysége még a hagyományos PCR eljárásnál is nagyobb, míg a szennyeződések lehetősége kisebb (COOKE és mtsai 2007). Azonban hamis negatívok és hamis pozitívok is előfordulhatnak (COOKE és mtsai 2007; SUTTON és mtsai 2007). Míg a korábbiakban említett módszerek a gazdanövényben vagy a talajban jelenlévő Phytophthora inokulum mennyiségi jellemzését nem tették lehetővé, a real-time PCR erre a kérdésre is képes választ adni (COOKE és mtsai 2007).

A PCR alapú technikák egyik legnagyobb hibája, hogy hamis pozitívként kimutatják a talajban vagy növényben jelenlévő, de már elpusztult micéliumot is (COOKE és mtsai 2007; O'BRIEN és mtsai 2009). Ennek kiküszöbölésére a nagyon rövid idő alatt lebomló RNS-ek vizsgálata adhat módot (COOKE és mtsai 2007).

Terepi vizsgálatokhoz egyéb, nem PCR technikával dolgozó DNS tesztek is alkalmazhatók (O'BRIEN és mtsai 2009). Ilyenek a DNS chipek macro- és microarray-ek, amelyek számos növényi kórokozó egyidejű azonosítását teszik lehetővé. Amellett, hogy akár komplex környezeti minták elemzésére is alkalmasak, bizonyos fokú kvantitatív elemzést is lehetővé tesznek (COOKE és mtsai 2007). Bár a hagyományos technológiáknál költségesebb eljárások, alkalmazásukat indokolja a gyors eredmény, mely a gazdálkodást és a kereskedelmet biztonságosabbá teszi és megkönnyíti.

DNS alapú molekuláris markerek

A fenti molekuláris technikák alkalmazásának eredményességét a megfelelően megválasztott molekuláris markerek alkalmazása teszi lehetővé. A megfelelő molekuláris marker eléggé változatos ahhoz, hogy megbízhatóan tudja elkülöníteni a közeli rokon fajokat is, de a fajon belüli változatossága nem olyan nagy, hogy veszélyeztetné annak lehetőségét, hogy minden törzset képes detektálni a vizsgálat (COOKE és mtsai 2007).

A RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA; véletlenszerűen felszaporított DNS polimorfizmus) vizsgálat alapja egy olyan PCR, amelyben az indítószekvenciák rövidek, véletlenszerűen is képesek a genomhoz kapcsológni,így lehetővé téve az amplifikációt. A módszer, jól felhasználható kapcsoltsági térképek készítésére, kapcsolt markerek fejlesztésére és a vizsgált szervezetről elsődleges információ megszerzésére (DEÁK 2010).

Az AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism; amplifikált fragmenshossz polimorfizmus) vizsgálat sziontén PCR alapú. Ez sem igényel előzetes információt a genommal kapcsolatban. A módszer előnye, hogy segítségével egyenletes eloszlásban, a teljes genomot lefedve nagy mennyiségű információhoz jutunk a vizsgált szervezetet illetően. Ezáltal a módszer alkalmas kapcsoltsági térképek készítésére és összehasonlító vizsgálatokra. (DEÁK 2010)

33

A RAPD és az AFLP markerek eredményeit jelenleg SCAR primerek tervezéséhez használják fel több Phytophthora faj esetében is (COOKE és mtsai 2007;

O'BRIEN és mtsai 2009). Ez a módszer a közeli rokon fajok vagy speciális törzsek elkülönítésére lehet alkalmas (COOKE és mtsai 2007)

A genomban található mikroszatellit régiók alkalmazásán alapuló technika is széles körben alkalmazható (SSR). A régiók határszekvenciái faj, sokszor nemzetség szinten konzerváltak, így azokra specifikus PCR primer tervezhető. A specifikus primerekkel felszaporított szakaszok sok esetben hossz-polimorfizmust mutatnak, így segítségükkel azonosíthatók fajták, azok származása, készíthetők kapcsoltsági térképek, vizsgálhatók populációk illetve kapcsolt tulajdonságok (DEÁK 2010). Alkalmazásukra a Phytophthora fajok kutatásában is van példa (SCHOEBEL és mtsai 2013).

Nukleotid szekvenciákon alapuló markerezés

Filogenetikai vizsgálatokban egyre gyakrabban kerül elő a nukleotid szekvenciákon alapuló markerezés. Ezekben az esetekben az egyes kiemelt szakaszok alapján feltárható evolúciós történetet vizsgáljuk. A vizsgálandó szakaszokkal szemben felmerülő alapvető követelmények, hogy egyes pontmutációk ne szelektálódjanak, ugyanakkor konzervált határolószekvenciákkal rendelkezzenek, amelyekre primerek tervezhetők. Ilyen szekvencia csoport a rRNS-t kódoló gének belső átírt szekvenciái (ITS) (DEÁK 2010).

Magi DNS markerek

Az ITS1-5.8S-ITS2 szakasz molekuláris markerként való alkalmazása a Phytophthora fajok detektálása, azonosítása és filogenetikai vizsgálata során általános (COOKE és mtsai 2007). Előnye, hogy meglehetősen stabil, univerzális primerek segítségével is könnyen amplifikálható és szekvenálható, sokszoros kópiaszámban fordul elő, és eléggé változatos ahhoz, hogy akár fajspecifikus primerek tervezésére nyújtson lehetőséget (COOKE és mtsai 2007; O'BRIEN és mtsai 2009). Habár, néhány közeli rokon faj esetében az ITS szakaszok meglehetősen hasonlóak is lehetnek, ami nehézkessé teheti a specifikus primerek megtervezését ebben az esetben (COOKE és mtsai 2007). Másrészt, előfordulhat, hogy olyan evolúciós változások következnek be, melyek lehetetlenné teszik a nemzetségben gyakori hibridek észlelését ITS szekvenciák alapján (O'BRIEN és mtsai 2009).

Az ITS régió jó alternatíváját jelenthetik a közeljövőben a riboszomális DNS IGS1 és IGS2 régiói is. Bár egyelőre még nincsenek effektív primerek, és a meglehetősen hosszú szakasz amplifikálása is nehézkes, előzetes vizsgálatok alapján ezek a régiók a közeli rokon fajok elkülönítését is lehetővé teszik. (COOKE és mtsai 2007)

Hasonló módon ígéretes alternatíva lehet az Ypt1 régió is (O'BRIEN és mtsai 2009). Ennek nem-kódoló szakaszai a ITS-hez hasonló mintázatot mutatnak. Fentiek mellett, egyéb gének is alkalmazhatók egyes fajok esetében (pl. Cina-6a-P. cinnamomi;

elicitin parA1 gén-P. nicotianae), de ezek nemzetség szintű alkalmazásra nem alkalmasak (COOKE és mtsai 2007).

A Phytophthora nemzetség leszármazási viszonyait bemutató, jelenleg elfogadott törzsfa több magi DNS marker felhasználása alapján készült (BLAIR és mtsai 2008). Több molekuláris marker együttes használata általában megbízhatóbb, pontosabb eredményt ad.

Mitokondriális DNS markerek

34

A vegetatív sejtekben található sok száz mitokondrium miatt, a mitokondriális DNS egyes szakaszai, mint a Cox1 és Cox2, is jól alkalmazhatók érzékeny detektálásra (O'BRIEN és mtsai 2009). Több tanulmány is bizonyította, hogy ezek a szakaszok is alkalmasak a nemzetség filogenetikai vizsgálatára is (MARTIN és TOOLEY 2003). A Cox2 és Cox1 gének közötti régió közeli rokon fajok elkülönítésére is alkalmas, hagyományos PCR technikák alkalmazásával is. Néhány hátránya is van azonban a mitokondriális DNS vizsgálatának: egyrészt, a magas AT/GC arány megnehezíti a hatékony primerek tervezését; másrészt, az amplifikáció csak megnövelt MgCl2

koncentráció mellett megy tökéletesen végbe (COOKE és mtsai 2007). Mivel a mtDNS csak anyai (oogónium) ágon öröklődik, a fajhibridek elkülönítésére nem alkalmas (COOKE és mtsai 2007; O'BRIEN és mtsai 2009).

3.3. A gazda-patogén kölcsönhatás fiziológiája: A kórokozó-gazdanövény-környezet