A kísérletek kivitelezése és analitikai módszerek

4.2.1. A közeg kialakítása

Sztatikus egyensúlyi kísérleteimet állandó hőmérsékleten (25°C), állandó ionerősséget biztosítva, a természetben előforduló pH-tartományban kiviteleztem. Így a közeg 0,05 mol/dm³ CaCl2-ot, illetve 0,1 mol/dm³ NaCl-ot és/vagy, 0,01 mol/dm³ koncentrációjú foszfát-puffert (NaH2PO4/Na2HPO4) tartalmazott úgy, hogy az egyensúlyi állapotban a hidrogén-ion koncentráció 10^-5, 10^-7, 10^-8 mol/dm³ legyen (pH=5, pH=7, pH=8). Néhány kísérletet puffer nélkül végeztem el.

A NaCl és a CaCl2 alkalmazásának oka, hogy a talajmintákból a jelentős mértékű humuszanyag-kioldódást definiált körülmények között próbáltam tartani (visszaszorítani), ezek a sók ugyanakkor a mikroorganizmusok elszaporodása ellen is hasznosak. A CaCl2

használata ilyen jellegű kísérleteknél közismert [99], szabványok, irányelvek [122] is alkalmazzák, például az OECD talajszennyezések szorpciós tulajdonságainak vizsgálatakor 0,01 mol/dm³ koncentrációban. A NaCl használatának ötletét az előbb említetteken kívül valós, a balatonfűzfői Nitrokémia 2000 Rt. területéről származó növényvédőszerrel

szennyezett talajminták/talajoldatok elemzése adta, amelyek a melléktermékként jelentkező NaCl-dal is terheltek. Télen az utak sózásával is tetemes mennyiségű NaCl jut a talajba.

Néhány klórszulfuronnal végzett vizsgálatnál a kísérleteket formázószer (Supragil WP, Borresperse 3A) jelenlétében kiviteleztem. Szükséges mennyiségüket a Glean nevű készítmény-ről kapott tájékoztató jellegű összetétel alapján állapítottam meg, miszerint a formázószer mennyisége a szerformátumban 1 m/m %. Ily módon nem valódi formált szert hoztam létre, hiszen egyéb adalékanyagokat nem adtam a hatóanyag és a formázószer keverékéhez.

Az oldatban lévő humuszanyag adszorpcióra gyakorolt hatását a 4.1.4.2. fejezetben ismertetett fulvosavval vizsgáltam. Ennek oldatbeli koncentrációját úgy alakítottam ki, hogy az oldat szervesanyag-tartalma a homoktalaj talajoldatában mért TOC értéket közelítse meg, így az 35 mg C/dm³volt. A fulvosav széntartalmában a megadott elemanalízis és az általam mért TOC eredmény értéke között különbség adódott (adott: 53,6%; saját mérés: 47%). Mivel eredményeim reprodukálhatóak voltak, az utóbbi értéket vettem beméréseim alapjául, tehát 35 mg C/dm³ koncentrációjú fulvosav oldat készítéséhez a bemért tömeg 74,5 mg literenként.

4.2.2. Növényvédőszer-oldatok készítése

Az izotermák meghatározásához minden esetben 10-15 tagú koncentrációsort készítettem.

Az alkalmazott analitikai módszer kimutatási határa és a vízoldhatóság szabta meg a hígítási sor alsó és felső értékét.

Az izoproturon és a prometrin csekély vízoldhatóságú, így a hatóanyagra nézve 34,35 mg/dm³, illetve 19,8 mg/dm³ törzsoldat koncentrációt alkalmaztam. Az oldódást mindkét esetben ultrahangos fürdővel segítettem elő. Izoproturon esetén a hígítási sort 166 µmol/dm³ törzsoldatból kiindulva készítettem el (koncentráció értékek 166; 158; 145,5; 133,1; 124,8;

116,5; 104; 91,5; 83,1; 70,7; 62,3; 52; 41,6; 31,2; 20,8; 0 µmol/dm³), prometrin esetében az alkalmazott koncentráció-tartomány 0-82 µmol/dm³ (82,0; 77,9; 71,8; 65,6; 61,5; 57,4; 51,3;

45,1; 41,0; 34,9; 30,8; 25,6; 20,5; 15,4; 10,2; 0 µmol/dm³).

Bár a klórszulfuron vízoldhatóbb az előbbi két vegyületnél, de sokkal kisebb mennyiséget juttatnak ki belőle a kívánt hatás eléréséhez, így a törzsoldat koncentrációját 40 mg/dm³-nek választottam, Glean esetében pedig 60 mg/dm³-nek. Ez utóbbi megfelel 45 mg/dm³ hatóanyag-tartalomnak. A hatóanyag oldódásának elősegítésére a szer hőérzékenysége miatt ultrahangos fürdőt nem alkalmaztam. Mivel a klórszulfuron oldhatósága erősen pH-függő, ezzel a vegyülettel csak pH=7-es közegben dolgoztam.

4.2.3. Sztatikus egyensúlyi kísérletek kivitelezése

Az adszorbensek előkészítéséhez 7 g talajmintát, illetve kvarc esetén 4 g-ot mértem be egy-egy lombikba, majd 5 cm³ adott pH-értékű és sótartalmú oldatot hozzáadva duzzadni hagytam egy napon át.

A duzzasztott adszorbensekhez az úgynevezett vak minta esetén 65 cm³ növényvédőszer-mentes adott sótartalmú és pH-jú puffer oldatot, a többi mintához a megfelelő közegben 65 cm³ különböző koncentrációjú növényvédőszer-oldatot adtam. Minden koncentráció értéknél 3 párhuzamost készítettem. Az így előkészített mintákat egy óráig 140-160 min^-1 sebességgel rázattam, majd egy napig állni hagytam, ugyanis az irodalmi adatok szerint [123] a dinamikus egyensúly az adszorbensen és az oldatban lévő hatóanyag koncentráció között 24 óra alatt beáll.

Az adszorpció időfüggésének vizsgálatával ellenőrizni kívántam az előbbi tényt. Ezért különböző adszorbensekkel, különböző pH-értékeken növényvédőszeres mintákat készítettem.

Minden egyes mintából 15 párhuzamost készítettem és belőlük 5 napon át napi 3-3 mintát HPLC-vel elemeztem.

Az 1 nap várakozás után a talajmintákat 20 percig Janetzky T23-as készülékkel centrifugáltam 3500 min^-1 sebességen. A centrifugálás után az oldatot redős szűrőn szűrtem, az első 10 cm³ szűrletet kiöntöttem, majd az oldat többi részét használtam fel az egyensúlyi koncentráció különböző analitikai módszerekkel történő közvetlen meghatározásához. Ezt az oldatot a továbbiakban a talajokkal végzett kísérletek esetén talajoldatnak nevezem (ez a megnevezés nem azonos a talajtanban használt talajoldat kifejezéssel).

Az adszorpciós mérések indirekt módját [5] választottam, amikoris adott tömegű talajra adott térfogatú, ismert koncentrációjú vizsgálandó oldatot juttatunk, meghatározzuk a vizsgálandó anyag egyensúlyi koncentrációját a vizes fázisban, majd ezen adatokból az (1) összefüggéssel kiszámítjuk az egységnyi adszorbensen adszorbeált hatóanyag mennyiségét.

Az izotermákon az egyensúlyi koncentráció függvényében ábrázolom a fajlagos adszorbeált hatóanyag (adszorbátum) mennyiségét.

4.2.4. Az adszorpció kivitelezése adott mennyiségű szerves anyag jelenlétében

E kísérlettel az volt a célom, hogy megvizsgáljam ismert mennyiségű szerves anyag jelenlétében (fulvosav) a növényvédőszer adszorpcióját szervesanyag-mentes természetes adszorbensen, a kvarcon. Ugyanez volt a célja annak a kísérletnek is, amikor homoktalajra olyan növényvédőszeres oldatot juttattam vissza, amely egy előzőleg készített, a talajra jellemző talajoldatból készült.

Az előbbi kísérletnél a hatóanyagnak választott izoproturon oldata minden koncentráció értéken 74,5 mg/dm³ fulvosavat tartalmazott, ami megfelel 35 mg C/l-nek. Az oldatokat HPLC-vel elemeztem, a vak mintát TOC-vel is.

Az utóbbi kísérletnél homoktalajra 0,01 mol/dm³ 7-es pH-jú puffer-oldatot tettem, azaz vak mintát készítettem nagy mennyiségben (talaj tömeg – folyadék térfogat arány a kísérlet során mindig 1:10). A talajoldatot lecentrifugáltam, majd ebből az oldatból készítettem el az izoproturon törzsoldatot és a hígítási sort, amit a kezeletlen homoktalajra juttattam vissza.

A kalibráló sort is a talajoldatban készítettem el. A minták egyensúlyi koncentrációinak meghatározásához HPLC-t használtam.

4.2.5. Bomlásvizsgálat kivitelezése

A választott kísérleti körülmények között különböző pH-kon és minden vizsgált adszor-bensen ellenőriztem az izoproturon stabilitását, bomlásáról próbáltam információt kapni.

Ehhez 10 g adszorbenst 5 cm³ megfelelő pH-jú, 0,1 mol/dm³ koncentrációjú NaCl-oldattal duzzasztottam, majd a következő napon 95 cm³ 25,2 mg/dm³ koncentrációjú izoproturon oldatot adtam hozzá. Mindegyik mintából négyet készítettem. Egy napig állni hagytam, majd minden mintából kettőt centrifugáltam, szűrtem, a folyadék fázist tartottam meg, míg a másik két mintát nem centrifugáltam, hagytam az adszorbenst is a lombikban a kísérlet befejezéséig, az egyensúly beálltától számított 334., illetve a 342. napig. A lombikokat lezárva, szoba-hőmérsékleten, természetes fényben (labor fénye) tartottam. Készítettem adszorbensmentes, kalibráló oldatot is, ezekben is folyamatosan vizsgáltam a bomlást. Minden egyes mérési napon (kezdetben gyakrabban, majd ritkábban) mintát vettem a folyadékfázisból és HPLC-vel elemeztem megfelelő kalibrálósorral elkészített analitikai mérőgörbe meghatározása után. Az első napon mért egyensúlyi koncentrációt tekintem a t=0-hoz tartozó koncentrációnak. Az eltelt idő függvényében ábrázoltam az egyensúlyi koncentrációt, majd egyes esetekben megbecsültem a felezési időt. A kísérlet befejeztével (néhol elérve a kiindulási koncentráció értékének felét, azaz a felezési időt) a folyadék és a szilárd fázis extrakciója után GC-MS-sel meghatározható bomlástermékeket kívántam azonosítani.

4.2.5.1. A bomlástermékek vizsgálatához szükséges extrakció megvalósítása

A bomlás során keletkezett, gázkromatográffal összekötött tömegspektrométerrel (GC-MS) azonosítható termékek mintaelőkészítéséhez a szilárd és a folyadék fázis megfelelő extrak-cióját alkalmaztam.

4.2.5.1.1. A szilárd fázis extrakciója

A szűrés után levegőn szárított adszorbensekből 5 g-ot 10 cm³ extraháló eleggyel (100 cm³ acetonos elegy, amely 2 cm³ 2 mol/dm³ ammónium-acetátot tartalmaz) rázógépen 1 óráig rázattam, majd Büchner-tölcséren szűrtem, az extraháló edényt 2 cm³ acetonnal öblítettem. Az egyesített kivonatokat választótölcsérbe vittem, 25 cm³ nátrium-szulfát-oldatot (40 g/dm³) adtam hozzá. Ezt követően a vizes acetonos fázist 10, majd 5 cm³ diklór-metánnal extraháltam, az egyesített szerves fázisokat vízmentes nátrium-szulfáttal szárítottam, szűrtem és szobahőmérsékleten légköri nyomáson bepárlódni hagytam. A mintát 5 cm³ izo-oktánban vettem fel és ezt az oldatot elemeztem GC-MS-sel.

4.2.5.1.2. A folyadék fázis extrakciója

A bomlásvizsgálatokból visszamaradt oldat 50 cm³-ét először 10, majd 5 cm³ diklór-metánnal extraháltam, az egyesített szerves fázisokat vízmentes nátrium-szulfáttal szárítottam, szűrtem, majd szobahőmérsékleten légköri nyomáson bepárlódni hagytam. A mintát 5 cm³ izo-oktánban vettem fel és ezt az oldatot elemeztem GC-MS-sel.

4.2.6. pH mérése és a talajoldatok pH- értékeinek beállítása

A talajoldatok pH-ját egy OP-0808P kombinált üvegelektróddal ellátott Radelkis Precision pH Meter OP 208/1 készülékkel állapítottam meg. A kalibráló oldatok a Radelkis gyártmányai.

Mivel a talajok – típustól függően – pufferkapacitással rendelkeznek, ezért a beállítandó pH-értékek esetén gondolni kellett arra, hogy a talajoldat pH-ja különbözni fog attól az oldatétól, amit ráöntöttünk. Ezért előzetesen megvizsgáltam, milyen pH-jú 0,01 mol/dm³ koncentrációjú NaH2PO4/Na2HPO4 puffert kell készíteni ahhoz, hogy egyensúlyban a kapott talajoldatok pH-ja a kívánt érték legyen.

4.2.7. Nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (továbbiakban: HPLC)

Vizsgálataimnál a vizes fázisban maradt herbicid koncentrációját határoztam meg. Ehhez Series 200 típusú (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, USA) és LaChrom D-7000 HPLC készüléket (Merck, Darmstadt, Németország; Hitachi High-Technologies Corp., Tokió, Japán) alkalmaztam. Előbbi diódasoros UV/VIS detektorral, gradiens pumpával, Turbochrom Workstation adatfeldolgozóval rendelkezik, utóbbi változtatható hullámhosszúságú UV detektorral, gradiens pumpával, HPLC System Manager adatfeldolgozóval felszerelt.

Mindkettőnél fordított fázisú, 5 µm-es kolonnatöltetű 125x4 mm-es LiChrospher 100 RP-18 oszlopot (Merck) használtam. Az injektált mennyiség az első műszer esetén 20 µl, a másodiknál 10 µl. Összehasonlító vizsgálatokat is végeztem, hogy megbizonyosodjak arról, hogy a két műszerrel kapott eredmények összevethetők-e.

A beoldódó humuszanyagoktól és más zavaró anyagtól a vizsgált vegyületeket izokratikusan választottam el, amelynek körülményei a 8. táblázatban találhatók. Klórszulfuron esetén kisebb mértékben támaszkodtam az irodalomra, hiszen azok erősen savas mozgófázist alkalmaznak [124]. Előkísérleteim szerint a 0,001 mol/dm³-es foszforsav eluenssel az oszlopról leoldott humuszanyagok és a vizsgálandó vegyület kromatográfiás csúcsa nem vált el, ezért savmentes mozgófázist választottam.

8. táblázat: A választott folyadékkromatográfiás körülmények Hatóanyag Eluens

(V/V%)

Áramlási sebesség (cm³/min)

Detektálási hullámhossz (nm)

IZOPROTURON MeCN/H2O = 60/40 0,7 240

PROMETRIN MeCN/H2O = 65/35 1,0 224

KLÓRSZULFURON 0,05M pH=7 puffer/

MeCN = 85/15 1,0 240

Minden HPLC-vel végzett méréssorozathoz az adott közegben készült hatóanyag hígítási sorából kalibrációt készítettem. Néhány növényvédőszeres talajoldat-minta kromatogramja az 1-3. függelékben látható.

4.2.8. UV-spektrofotometria (továbbiakban: UV)

A nem specifikus, de gyors és olcsó spektrofotometriai méréshez a SECOMAM PASTEL UV készüléket (Secomam, Domont, Franciaország) használtam, amely egy többparaméteres hordozható analizátor. A kapott abszorbancia értékeket összehasonlítottam egy UV-160 A SHIMADZU típusú spektrofotométer készülék (Shimadzu, Japán) eredményeivel. A kapott adatok jó egyezést mutattak a hordozható készülék által meghatározottakkal, így a további-akban ezzel végeztem méréseimet kvarc küvettával, 5 mm-es fényút hosszon, valamint egy VARIAN UV-VIS Cary50 Conc nevű kétutas készülékkel (Varian Australia Pty. Ltd., Mulgrave, Ausztrália). Ezzel a műszerrel is elvégeztem az összehasonlító vizsgálatot.

Az alkalmazott hullámhosszt úgy választottam meg, hogy a talajoldat-vak elnyelése minimális, a hatóanyagoké pedig maximális (a hatóanyagra jellemző) legyen. Így izoproturon és klórszul-furon esetén 240 nm, prometrin esetén 224 nm az alkalmazott hullámhossz. A hatóanyagok UV-spektrumait a 1-3. függelékben tüntettem fel. A törzsoldatokból – amelyeket a megfelelő közeggel hoztam létre – kalibráló sort készítettem. A mintáimat úgy hígítottam, hogy az abszorbancia a lineáris, úgynevezett Lambert-Beer tartományba essen. Igyekeztem elkerülni a hígítást, mert feltételezhető, hogy hígításkor az oldatban korábban létrejött asszociátumok szétesnek, megváltoznak. A SECOMAM PASTEL UV készüléknél a talajoldat-vakokra mért abszorbancia értékeket levontam a mintákra mért értékekből, mivel a műszer egyutas, majd az analitikai mérőgörbe segítségével megállapítottam a minták hatóanyag-tartalmát.

4.2.9. Összes szerves szén meghatározása (továbbiakban: TOC)

A vizes fázis szervesanyag-tartalmára az összes szerves szén meghatározásából következtettem. Ehhez az alacsony hőmérsékleten (kb. 70 °C) nátrium-peroxo-diszulfáttal (1,5 mol/dm³ Na2S2O8-oldat) és ultraibolya fénnyel oxidáló Foss-Heraeus liquiTOC készüléket (Foss-Heraeus Analysensysteme GmbH, Hanau, Németország) használtam, amely alkalmas vizes oldatok szervetlen szén- (TIC), szerves szén- (TOC) és összes széntartalmának (TC) elemzésére. A szervetlen szén mennyiségét a karbonátok, hidrogén-karbonátok foszforsavval (1,75 mol/dm³) történő bontásakor fejlődő, míg a szerves szén mennyiségét az oxidáció révén keletkező CO2 meghatározásából kapjuk meg infra detektor segítségével. Adott térfogatú mintá-hoz a rendszer automatikusan adagolja a reagenseket, majd a keletkező CO2-t nagy tisztaságú nitrogén vivőgázzal fúvatjuk az infra érzékelőbe. A készülék először a TIC-értéket határozza meg, ezután a TOC-t, s a szén koncentrációt mg C/l mértékegységben adja meg.

Mintáink elemzését adott mérési tartományban adott koncentrációjú standard oldat felhasz-nálásával lehet elvégezni. A lehető legpontosabb eredmények érdekében a sztatikus egyensúlyi kísérletek esetében kalibráló oldatnak a vizsgált hatóanyagból készített törzsoldatot használtam.

TOC meghatározásnál leggyakrabban ajánlott kalibráló a kálium-hidrogén-ftalát megfelelő hígítású oldata (50 mg C/l). Ezt használtam, amikor a talajoldat-vakokat összehasonlító céllal mértem. A hatóanyag vizsgálatánál is szükség volt a vak minta TOC-jének meghatározásához, ekkor már a hatóanyagból készített kalibráló oldattal dolgoztam. Háromszoros kalibrációt és mintamérést végeztem, minden mérésnapon elvégeztem a hígításra alkalmazott víz elemzését is. A talajoldat-vakok átlagait levonva a növényvédőszeres mintákra kapott átlagértékekből kaptam meg az oldatok egyensúlyi növényvédőszer koncentrációját mg C/l mértékegységben.

A mintákban lévő halogenid-ionok – esetemben klorid-ionok – zavaró hatásúak, mivel oxidációjukkor gáz képződik és e folyamat a reagens oldatot fogyasztja, azaz a mérés bizonytalanná válik. Ezért mérés előtt el kellett ezeket az ionokat távolítanom a mintákból.

Erre a KOI meghatározás szabványában [125] is szereplő higany(II)-szulfátot alkalmaztam (ugyanis ezüst-nitrát esetén csak centrifugálás után szűrhető szuszpenziót kaptam).

Adott térfogatú és klorid-ion koncentrációjú talajoldathoz sztöchiometriai mennyiségben ad-tam a reagenst higany(II)-klorid és higany(II)-tetrakloro-komplex ([HgCl4]^2-) [kloro-merkurát]

képződésére számítva. A kapott csapadékot szűréssel távolítottam el, bár a készülék alkalmas szuszpenziók elemzésére is. Mivel a higany(II)-szulfát miatt a TOC-s meghatározás már nem környezetkímélő eljárás, ezzel a módszerrel csupán néhány izotermát készítettem, az alkalmazott analitikai módszerekkel kapott eredmények összehasonlítása céljából, illetve a vak mintákból határoztam meg a TOC értéket a kioldódó szerves anyagokra.

4.2.10. Bomlástermékek vizsgálata tömegspektrometriával (továbbiakban: GC-MS)

A bomlásvizsgálat végeztével a minták folyadék és szilárd fázisának extrakciójával nyert mintákat GC-MS módszerrel elemeztük, az esetleges bomlástermékeket kutatva, illetve, össze-hasonlítottam, hogy a különböző körülmények eltérő bomlástermékeket eredményeztek-e.

Az alkalmazott készülék a Shimadzu GC 17A gázkromatográf QP 5000 MS detektorral (Shimadzu, Japán). A használt kolonna HP-1-es típusú, jellemzői: 15 x 0,25 mm x 0,25 µm film. A hőmérsékletet a következő program szerint alakítottuk: 50 °C 4 percig, majd 10 °C/perc fűtési sebességgel 280 °C-ig. A vivőgáz hélium, az ionizáló feszültséget 70 eV-nak választottuk.