Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak

az Európai Unió új társadalmi kihívásainak

a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

REKOMBINÁNS ANTITESTEK ÉS A PHAGE DISPLAY TECHNIKA

az Európai Unió új társadalmi kihívásainak

a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Csősz Éva

Molekuláris terápiák – 7. előadás

A 7. fejezet célja, hogy bemutassa a terápiák során felhasznált antitestek termelésének lehetőségeit és korlátait. A fejezet során bemutatásra kerül az antitestek termelődésének folyamata, a terápiás antitestek termelése hibridómákban illetve a nagyfokú antitest diverzitás biztosítása fág diszplay segítségével.

A 7. fejezet témakörei 7.1. Áttekintés

7.1.1. Az antitestek szerkezete és termelődése a szervezetben 7.1.2. Antigén – antitest kölcsönhatás

7.2. A terápiás antitestek termelése

7.2.1. Antitestek termelése hibridómákban 7.2..2. Humanizált antitestek

7.2.3. Humán antitestek termelése

7.3. Antitestek termelése fág diszplay segítségével 7.3.1. A fág diszplay technika bemutatása 7.3.2. Fág könyvtárak készítése

7.4. A terápiás antitestek alkalmazása

Nehéz lánc:

konstans régió, variábilis régió

Könnyű lánc:

konstans régió, variábilis régió Hinge régió

Szupervariábilis régió

Diszulfid hidak

COO^-

COO^-

COO^- COO^-

NH₃⁺ NH₃⁺

NH₃⁺ NH₃⁺

V

V

V

V

C_H3

C_L C_L

C_H2 C_H1

C_H1

F

régió

Fc régió

Az antitestek szerkezete

V_H1 V_H2 V_H3 V_H4 V_Hn D_H1 D_Hn J_H1 ^J_H2 ^J_H3 ^J_Hn ^C_µ C







α

J_H2 D_H1

V_H4 C

 IgG

Nehéz lánc

kb. 85 gén kb. 27 gén kb. 6 gén

Az antitestek nehéz láncának szerkezete

V_L1 V_L2 V_L3 V_L4 V_Ln J_L1 J_L2 J_L3 J_Ln C

J_L3

V_L2 C kappa könnyű lánc kb. 35 kappa gén kb. 5 kappa gén

kb. 30 lambda gén kb. 4 lambda gén

Az antitestek könnyű láncának szerkezete

B sejt

Antitest

Az antitestek termelése a B sejtekben

Rekombináció Kapcsolódási diverzitás Szomatikus hipermutáció

B sejt

Antigén/epitóp

Plazma sejt Specifikus antitest BCR

Y Y Y Y

B sejt

Klonális szelekció

Klonális expanzió

A klonális szelekció és klonális expanzió

Y

Y Y

Y

B sejt B sejt

B sejt

Antitest

Antigén

Epitóp

Antitest

Poliklonális antitestek

B sejt

Antigén

Epitóp

Antitest

Monoklonális antitestek

Lépsejtek izolálása

HGPRT Antitest termelés

Mielóma sejtek

HGPRT  Antitest termelés 

Egér immunizálása Antigén

Lépsejtek és mielóma sejtek fúziója, a hibridóma

sejtek létrehozása

Hibridómák szűrése és szaporítása

Antitestek izolálása

Y Y Y Y

Y Y

Y

Antitestek termelése hibridómákban

Egér antitest Humán antitest

Humanizált antitest / kiméra antitest

Humanizált antitestek

Egér immunoglobulin gén

Humán immunoglobulin gén

Humán vagy humanizált antitestek termelése

Humán antitestek termelése génmódosított egerekben

5 db p9

5 db p7 5 db p3

5 db p6

2700 db p8

DNS - 6.4 kb M13 bakteriofág

E. coli 900 nm

Az M13 bakteriofág szerkezete

F-pilus

Immobilizált fehérje / affinitás mátrix

Specifikus elúció

Az immobilizált fehérjékhez kötött fágok specifikus elúciója

mátrix

Enzim fág diszplay

mátrix

Szubsztrát fág diszplay I.

mátrix mátrix

Szubsztrát fág diszplay II.

mátrix

Enzim-szubsztrát fág diszplay I.

mátrix mátrix

Enzim-szubsztrát fág diszplay II.

Fágmid

Rekombináns fágmid

Változatos szekvenciák sokasága

Fág könyvtárak készítése

hGH gén Proteáz szubsztrát M13 gIII gén

Fágmid vektor

hGH gén Proteáz szubsztrát M13 gIII gén

Fágmid vektor Változatos szekvenciák

létrehozása

Fág könyvtár Proteáz szubsztrát

szekvencia

Proteáz szubsztrát fág könyvtár készítése

hGH receptor

mátrix Proteáz

Alacsony pH

Proteáz rezisztens szekvenciák

Proteáz érzékeny szekvenciák

Szekvenálás Proteáz

Szubsztrát fág diszplay – proteáz hasítóhelyek fejlesztése

Fág könyvtár beadása

intravénásan

A fágok az erek falán expresszált

fehérjékhez kötődnek

Biopszia

A kötődött fágok lemosása

A kötődött fágok szaporítása A fágok által hordozott

peptidek/fehérjék azonosítása

In vivo fág diszplay – ér endothel sejtek térképezése

Limfociták

mRNS

cDNS

Antitest specifikus primer Teljes vér

(Immunizált donor)

Antitest gének

Fágmid

E. coli sejtek

10⁸ különböző antitest génjét tartalmazzák

Antitest könyvtárak készítése teljes vérből

Tumor sejt

Ölő sejt (NK sejt vagy monocita)

Tumor ellenes antitestek

Fc receptor

Antitest függő citotoxicitás mechanizmusa

TNFalfa

IL2 receptor alfa lánc

Transzplantáció utáni szervkilökődés

megakadályozására, főként veseátültetések esetén

• Pszoriázis

• Reumatoid arthritisz

• Crohn betegség

• Spondilitisz

Humán-egér kiméra antitest Monoklonális antitestek

• Adalimumab

• Infliximab

• Golimumab

• Cetrolizumab pegol

Basiliximab

Immunszupresszáns hatású terápiás antitestek alkalmazása

Bispecifikus antitest (kb. 300 kDa)

IgG - scFv

(Fab – scFv)₂

A terápiás antitestek változatai

Fv

Tandem scFv Diabody Triabody Bispecifikus antitest F(ab’)₂

Fab

scFv

S-S

scFv₂ dsFv

S-S

Nanobody

A kisméretű terápiás antitestek változatai