az Európai Unió új társadalmi kihívásainak
a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen
Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 1.
az Európai Unió új társadalmi kihívásainak
a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen
Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Scholtz Beáta
Molekuláris Terápiák – 1. előadás
1.1 DEFINÍCIÓK
1.2 A BETEGSÉGEKRŐL
1.3 A BETEGSÉGMECHANIZMUSOK FELTÁRÁSÁNAK MÓDSZEREI 1.3.1 A génexpresszió szabályozásának alapesetei
1.3.2 Microarray-k: Funkcionális genomika a rákterápia fejlesztéséért 1.3.3 Genetikai aberrációk és betegségek
1.3.4 Genom microarray-k
1.3.4.1. Array összehasonlító genom hibridizáció (aCGH)
A fejezet célja, hogy ismertesse a funkcionális genomika célkitűzéseit és legfontosabb módszereit. Konkrét példákon kereszül bemutatjuk, hogyan járulhat hozzá ez a tudományág az orvostudomány
fejlődéséhez.
FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 1.
4
Definíciók
Genomika: a genomok, azaz az élőlények DNS állományának vizsgálata,
bioinformatikai eszközökkel. Előfeltétele: genomszekvenciák adatbázisokban. Statikus: a genomszekvenciák elvileg nem (igen lassan) változnak.
Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával.
Funkcionális genomika:
Genotípus és fenotípus korrelációk. Globális, nagy
áteresztő-képességű módszerek segítségével vizsgálni a gének és termékeik funkcióit.
• Normál és patológiás állapotokban
• A környezeti változások hatására
• Különböző élőlények összehasonlítása
Mi a funkcionális genomika?
Funkcionális genomika:
Globális (genom-szintű vagy rendszer-szintű) kísérleti módszerek kifejlesztése és alkalmazása, melyek a strukturális genomika
reagenseivel és információival együtt alkalmas a gének funkcióinak vizsgálatára. Jellemzően nagy áteresztő-képességű, sok mintát
vizsgáló kísérletes megközelítéseket jelent, melyeket az eredmények számítógépes, statisztikai analízise egészít ki (Hieter and Boguski 1997).
A fenotípus vizsgálatra használt funkcionális genomika elsősorban abban különbözik a klasszikus módszerektől, hogy lényegesen több
mintát/adatpontot vizsgál, és erősen automatizált. Egy klasszikus
génexpressziós kísérlet azt vizsgálhatja, hogy hogyan változik egy gén aktivitása az egyedfejlődés során in vivo. Modern funkcionális
genomikai megközelítéssel ezzel szemben azt vizsgáljuk, hogy hogyan változik gének ezreinek-tízezreinek az aktivitása az egyedfejlődés
során. (UCDavis Genome Center)
6
• A genetikai variációk teszik lehetővé az evolúció motorjaként szolgáló adaptív változásokat.
• Bizonyos változások javítják a faj alkalmazkodó-képességét. Mások káros hatásúak.
• A faj bizonyos egyedei számára a káros változatok betegséget okozhatnak.
• Molekuláris szemszögből: mutáció és variáció
• Orvosi szemszögből: patológiás állapot
Emberi betegségek: a változatok következményei
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
• A genom sok régióját érintheti
• Sokféle mutációs mechanizmus létezik
• A gének és termékeik kölcsönhatásban vannak a molekuláris környezetükkel
• Az egyén olyan kölcsönhatásba kerülhet környezetével, ami elősegíti a betegség kialakulását
Miért van olyan sokféle betegség?
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
8
• Orvoslás: diagnózis, kezelés, prognózis, megelőzés
• Genetika: megérteni az egyedi fenotípus hátterét és kialakulását
• Genomika/funkcionális genomika: gének azonosítása és karakterizálása.
Kromoszomális elrendeződésük, betegségekben betöltött szerepük és funkcióik
• Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával.
Egy betegség különböző perspektívákból
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával.
• A DNS adatbázisokban tárolt referencia szekvenciák a normál és betegséggel kapcsolható szekvenciák összehasonlítására is használhatók
• A fizikai és genetikai térkép betegség-gének azonosítására alkalmas
• A proteinek szerkezetét vizsgáló kísérletek értelmezhetik a mutációk hatásait
• A géneket többféle funkcionális genomikai módszerrel tanulmányozzák
• A betegségekkel kapcsolt génekről sok minden megállapítható az ortológ gének és funkcióik összehasonlításával
Egy betegség a bioinformatika szemszögéből
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
10 Négy alapvető betegségtípus:
A betegségek alaptípusai
• Monogénes
• komplex
• genomikai
• környezeti
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
Egygénes betegségek ritka többgénes patofiziológia autoszomális domináns
autoszomális recesszív X-kapcsolt recesszív
Komplex betegségek gyakori többgénes központi idegrendszer
kardiovaszkuláris
veleszületett rendellenességek
Kromoszóma elváltozások gyakori többgénes Fertőző betegségek leggyakoribbtöbbgénes
Környezet okozta betegségek leggyakoribb többgénes
A betegségek alaptípusai
12
• Korábban szigorúan elválasztották egymástól az egygénes és a többgénes (komplex) betegségeket. Ma már inkább
átfedőnek látjuk őket.
• Az egygénes betegségeket definiálhatjuk úgy, hogy a rendellenességet elsősorban egy gén mutációi váltják ki.
Ettől függetlenül, a patofiziológia kialakításában több gén is részt fog venni.
Egygénes betegségek
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
Betegségek alaptípusai: Komplex betegségek
• Az egygénes betegségek 90%-a serdülőkorra manifesztálódik
• 1%-uk 50 éves kor fölött jelentkezik
• A komplex betegségek jellemzően később jelentkeznek
• Ha korán jelentkeznek, a tünetek lényegesen súlyosabbak
• Példák: fejlődési rendellenességek, korai asztma, magas vérnyomás, rák, cukorbetegség
• A komplex betegségek fenotípusa gradiens mentén változik a populációban
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
14
Komplex betegségek
Több gén felelős a kialakulásukért. A génekben található mutációk vagy szekvencia variánsok együttes kombinációja határozza meg a betegséget.
A komplex betegségek nem mutatnak Mendeli öröklődést:
családokban halmozottan fordulhatnak elő, de nem szegregálódnak.
Ezért a szokásos genetikai analízisekkel (pl. linkage) nem könnyű azonosítani az érintett géneket még a családok ismeretében sem.
A hajlamosító allélek gyakoriak a populációban.
Komplex betegségek például: asztma, autizmus, magas vérnyomás, elhízás, csontritkulás.
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
Genomi - kromoszomális - betegségek
Sok betegség hátterében kromoszomális deléciók, duplikációk vagy átrendeződések állnak. Előfordulhat aneuploidia is, azaz a normálistól eltérő kromoszómaszám.
Ezeket a betegségeket bioinformatikai szempontból genomi microarray kísérletekkel érdemes tanulmányozni.
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
16
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
Duchenne izomdisztrófia (1986) Cisztikus fibrózis (1989)
Huntington betegség (1993) BRCA1 és 2 - emlőrák (1994)
Fizikai térképezéssel azonosított betegséggének
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
18
Autoszómás domináns
BRCA1, BRCA2 1:1000
Huntington chorea 1:2,500 Tuberous sclerosis 1:15,000 Autosomal recessive
Albinizmus 1:10,000
Sarlósejtes anémia 1:655 (U.S. fekete) Cisztikus fibrózis 1:2,500 (Európa)
Fenilketonuria 1:12,000
X-kapcsolt
Hemofília A 1:10,000 (férfiak) Rett szindróma 1:10,000 (nők)
Törékeny X szindróma 1:1,250 (férfiak)
Egygénes betegségek
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
Példa:
Az ólommérgezés környezet okozta betegségnek tekinthető.
Elég gyakori - az USA-ban élő gyermekek 9%-ában magas a vér ólomszintje.
De ugyanolyan ólomterhelésnek kitett gyermekek fenotípusa egészen különböző lehet.
A különbséget az eltérő genetikai háttér okozza.
Következtetés: a genetikai háttér befolyásolja a környezeti tényezők vagy fertőző ágensek hatására kialakuló betegségek manifesztációját. Még egygénes betegségeknél is több gén megváltozott működése alakítja ki a végső fenotípust.
Betegségtípusok: környezet okozta betegségek
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
20
Mitokondriumok:
Több mint 100 betegség-okozó mutáció ismert Peroxiszómák:
A mutációk vagy a peroxiszóma funkciót, vagy az organellum biogenezisét érintik. Élesztőben jól modellezhetők.
Lizoszómák
Egyéb betegségtípusok: az organellumok betegségei
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
A humán mitokondriális genom morbiditási térképe
DiMauro and Schon, 2001
22
http://www.peroxisome.org
A betegségmechanizmusok feltárásának módszerei
Egygénes betegségek: Genetika és genomika
Módszerek: linkage analízis, genom-szintű asszociációs vizsgálatok, kromoszóma aberrációk azonosítása, genom DNS szekvenálás
Többgének betegségek: genomika, funkcionális genomika, genetika stb.
A globális analízisek azonosíthatják a molekuláris terápia célpontjait!
1. Betegségokozó gének: (kardiovaszkuláris, diabétesz, Alzheimer-kór)
2. Gének és a környezet közötti interakciók, melyek krónikus betegségekhez vezethetnek
3. A rák különböző aspektusai
• terápiás válasz
• prognózis
• kiújulás
4. Alapvető kérdések a gének szabályozásával kapcsolatban.
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
24
• szervszintű (pl. agyban vagy vesében)
• az egyedfejlődés során (pl. magzati vagy felnőtt szövetek)
• a környezeti hatásokra adott dinamikus válasz (pl. korai válaszadó gének)
• betegség hatására
• génaktivitás
Génexpresszió és betegségek: jó korreláció az RNS expressziós szintek és a fenotípus között.
A génexpresszió szabályozásának alapesetei
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
cDNS
DNS RNS protein
cDNS
DNS RNS protein
UniGene SAGE Microarray
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
A génexpresszió globális analízise
26
A génexpresszió az a folyamat, melynek során a génben levő információ struktúrákká (protein) és sejtbeli funkciókká fordítódik le.
A microarray alapkoncepciója, hogy egyedileg mérje a mRNS-ek mennyiségét, és ezáltal azonosítsa, mely géneket expresszálja (használja) a sejt.
Microarray
cDNS
DNS RNS protein
cDNS
DNS RNS protein
Pillanatfelvétel, mely egyszerre többezer gén aktivitását rögzíti.
Szabályos mátrixba rendezett, próbákat tartalmazó mikropöttyök összessége, ahol minden pötty egyféle szekvenciájú nukleinsavat (próbát) tartalmaz,
ami egy génnek felel meg.
Génexpressziós microarray-k
A rendszer alkotóelemei:
• szilárd hordozófelület
• DNS próbák: cDNS vagy oligonukleotida, ismert gének homológjai
• Vizsgálandó minták (mRNS-ből jelölt cDNS)
• Szkenner (szignál rögzítés)
• Számítógépes algoritmus (adatelemzés)
28
Affymetrix expressziós array-k
30 Kontroll
Teszt
Fluoreszcensen jelölt próbák készítése
Hibridizálás mosás szkennelés
Fluoreszcencia mérése, két
csatornán piros zöld
Adatanalízis génexpressziós mintázat azonosítása
Nyomtatott expressziós array-k
Kontroll
Teszt
Biotinnal jelölt próbák készítése
Hibridizálás festés
mosás Szkennelés
Analízis
Affymetrix expressziós array-k
32
A microarray minőségi konzorcium (MAQC)
A MAQC Konzorcium cikksorozatot publikált a Nature Biotechnology- ban : 2006 szeptember, 24(9).
20 mikroarray terméket és háromféle technológiát értékeltek, 12000 RNS transzkript expresszióját vizsgálva humán tumorsejtvonalakban vagy
agyszövetben. A kísérleteket végző laboratóriumok és a különböző platformok eredményeiben (szabályozott gének) nagyban megegyeztek.
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
34
MAQC Konzorcium (2006) Nature Biotechnology 24:1151-1161