Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak

(1)

az Európai Unió új társadalmi kihívásainak

a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

(2)

FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 1.

az Európai Unió új társadalmi kihívásainak

a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Scholtz Beáta

Molekuláris Terápiák – 1. előadás

(3)

1.1 DEFINÍCIÓK

1.2 A BETEGSÉGEKRŐL

1.3 A BETEGSÉGMECHANIZMUSOK FELTÁRÁSÁNAK MÓDSZEREI 1.3.1 A génexpresszió szabályozásának alapesetei

1.3.2 Microarray-k: Funkcionális genomika a rákterápia fejlesztéséért 1.3.3 Genetikai aberrációk és betegségek

1.3.4 Genom microarray-k

1.3.4.1. Array összehasonlító genom hibridizáció (aCGH)

A fejezet célja, hogy ismertesse a funkcionális genomika célkitűzéseit és legfontosabb módszereit. Konkrét példákon kereszül bemutatjuk, hogyan járulhat hozzá ez a tudományág az orvostudomány

fejlődéséhez.

FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 1.

(4)

4

Definíciók

Genomika: a genomok, azaz az élőlények DNS állományának vizsgálata, bioinformatikai eszközökkel. Előfeltétele: genomszekvenciák adatbázisokban. Statikus: a genomszekvenciák elvileg nem (igen

lassan) változnak.

Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával.

Funkcionális genomika:

Genotípus és fenotípus korrelációk. Globális, nagy áteresztő-képességű módszerek segítségével vizsgálni a gének és termékeik funkcióit.

• Normál és patológiás állapotokban

• A környezeti változások hatására

• Különböző élőlények összehasonlítása

(5)

Mi a funkcionális genomika?

Funkcionális genomika:

Globális (genom-szintű vagy rendszer-szintű) kísérleti módszerek kifejlesztése és alkalmazása, melyek a strukturális genomika

reagenseivel és információival együtt alkalmas a gének funkcióinak vizsgálatára. Jellemzően nagy áteresztő-képességű, sok mintát vizsgáló kísérletes megközelítéseket jelent, melyeket az eredmények

számítógépes, statisztikai analízise egészít ki (Hieter and Boguski 1997).

A fenotípus vizsgálatra használt funkcionális genomika elsősorban abban különbözik a klasszikus módszerektől, hogy lényegesen több

mintát/adatpontot vizsgál, és erősen automatizált. Egy klasszikus

génexpressziós kísérlet azt vizsgálhatja, hogy hogyan változik egy gén aktivitása az egyedfejlődés során in vivo. Modern funkcionális

genomikai megközelítéssel ezzel szemben azt vizsgáljuk, hogy hogyan változik gének ezreinek-tízezreinek az aktivitása az egyedfejlődés

során. (UCDavis Genome Center)

(6)

6

• A genetikai variációk teszik lehetővé az evolúció motorjaként szolgáló adaptív változásokat.

• Bizonyos változások javítják a faj alkalmazkodó-képességét. Mások káros hatásúak.

• A faj bizonyos egyedei számára a káros változatok betegséget okozhatnak.

• Molekuláris szemszögből: mutáció és variáció

• Orvosi szemszögből: patológiás állapot

Emberi betegségek: a változatok következményei

J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics

(7)

• A genom sok régióját érintheti

• Sokféle mutációs mechanizmus létezik

• A gének és termékeik kölcsönhatásban vannak a molekuláris környezetükkel

• Az egyén olyan kölcsönhatásba kerülhet környezetével, ami elősegíti a betegség kialakulását

Miért van olyan sokféle betegség?

(8)

8

• Orvoslás: diagnózis, kezelés, prognózis, megelőzés

• Genetika: megérteni az egyedi fenotípus hátterét és kialakulását

• Genomika/funkcionális genomika: gének azonosítása és karakterizálása.

Kromoszomális elrendeződésük, betegségekben betöltött szerepük és funkcióik

• Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával.

Egy betegség különböző perspektívákból

(9)

Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával.

• A DNS adatbázisokban tárolt referencia szekvenciák a normál és betegséggel kapcsolható szekvenciák összehasonlítására is használhatók

• A fizikai és genetikai térkép betegség-gének azonosítására alkalmas

• A proteinek szerkezetét vizsgáló kísérletek értelmezhetik a mutációk hatásait

• A géneket többféle funkcionális genomikai módszerrel tanulmányozzák

• A betegségekkel kapcsolt génekről sok minden megállapítható az ortológ gének és funkcióik összehasonlításával

Egy betegség a bioinformatika szemszögéből

(10)

10 Négy alapvető betegségtípus:

A betegségek alaptípusai

• Monogénes

• komplex

• genomikai

• környezeti

(11)

Egygénes betegségek ritka többgénes patofiziológia autoszomális domináns

autoszomális recesszív X-kapcsolt recesszív

Komplex betegségek gyakori többgénes központi idegrendszer

kardiovaszkuláris

veleszületett rendellenességek

Kromoszóma elváltozások gyakori többgénes

Fertőző betegségek leggyakoribb többgénes

Környezet okozta betegségek leggyakoribb többgénes

A betegségek alaptípusai

(12)

12

• Korábban szigorúan elválasztották egymástól az egygénes és a többgénes (komplex) betegségeket. Ma már inkább

átfedőnek látjuk őket.

• Az egygénes betegségeket definiálhatjuk úgy, hogy a rendellenességet elsősorban egy gén mutációi váltják ki.

Ettől függetlenül, a patofiziológia kialakításában több gén is részt fog venni.

Egygénes betegségek

(13)

Betegségek alaptípusai: Komplex betegségek

• Az egygénes betegségek 90%-a serdülőkorra manifesztálódik

• 1%-uk 50 éves kor fölött jelentkezik

• A komplex betegségek jellemzően később jelentkeznek

• Ha korán jelentkeznek, a tünetek lényegesen súlyosabbak

• Példák: fejlődési rendellenességek, korai asztma, magas vérnyomás, rák, cukorbetegség

• A komplex betegségek fenotípusa gradiens mentén változik a populációban

(14)

14

Komplex betegségek

Több gén felelős a kialakulásukért. A génekben található mutációk vagy szekvencia variánsok együttes kombinációja határozza meg a betegséget.

A komplex betegségek nem mutatnak Mendeli öröklődést:

családokban halmozottan fordulhatnak elő, de nem szegregálódnak.

Ezért a szokásos genetikai analízisekkel (pl. linkage) nem könnyű azonosítani az érintett géneket még a családok ismeretében sem.

A hajlamosító allélek gyakoriak a populációban.

Komplex betegségek például: asztma, autizmus, magas vérnyomás, elhízás, csontritkulás.

(15)

Genomi - kromoszomális - betegségek

Sok betegség hátterében kromoszomális deléciók, duplikációk vagy átrendeződések állnak. Előfordulhat aneuploidia is, azaz a normálistól eltérő kromoszómaszám.

Ezeket a betegségeket bioinformatikai szempontból genomi microarray kísérletekkel érdemes tanulmányozni.

(16)

J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics 16

(17)

Duchenne izomdisztrófia (1986) Cisztikus fibrózis (1989)

Huntington betegség (1993) BRCA1 és 2 - emlőrák (1994)

Fizikai térképezéssel azonosított betegséggének

(18)

18

Autoszómás domináns

BRCA1, BRCA2 1:1000

Huntington chorea 1:2,500

Tuberous sclerosis 1:15,000

Autosomal recessive

Albinizmus 1:10,000

Sarlósejtes anémia 1:655 (U.S. fekete)

Cisztikus fibrózis 1:2,500 (Európa)

Fenilketonuria 1:12,000

X-kapcsolt

Hemofília A 1:10,000 (férfiak)

Rett szindróma 1:10,000 (nők)

Törékeny X szindróma 1:1,250 (férfiak)

Egygénes betegségek

(19)

Példa:

Az ólommérgezés környezet okozta betegségnek tekinthető.

Elég gyakori - az USA-ban élő gyermekek 9%-ában magas a vér ólomszintje.

De ugyanolyan ólomterhelésnek kitett gyermekek fenotípusa egészen különböző lehet.

A különbséget az eltérő genetikai háttér okozza.

Következtetés: a genetikai háttér befolyásolja a környezeti tényezők vagy fertőző ágensek hatására kialakuló betegségek manifesztációját. Még egygénes betegségeknél is több gén megváltozott működése alakítja ki a végső fenotípust.

Betegségtípusok: környezet okozta betegségek

(20)

20

Mitokondriumok:

Több mint 100 betegség-okozó mutáció ismert

Peroxiszómák:

A mutációk vagy a peroxiszóma funkciót, vagy az organellum biogenezisét érintik. Élesztőben jól modellezhetők.

Lizoszómák

Egyéb betegségtípusok: az organellumok betegségei

(21)

A humán mitokondriális genom morbiditási térképe

DiMauro and Schon, 2001

(22)

22

http://www.peroxisome.org

(23)

A betegségmechanizmusok feltárásának módszerei

Egygénes betegségek: Genetika és genomika

Módszerek: linkage analízis, genom-szintű asszociációs vizsgálatok, kromoszóma aberrációk azonosítása, genom DNS szekvenálás

Többgének betegségek: genomika, funkcionális genomika, genetika stb.

A globális analízisek azonosíthatják a molekuláris terápia célpontjait!

1. Betegségokozó gének: (kardiovaszkuláris, diabétesz, Alzheimer-kór)

2. Gének és a környezet közötti interakciók, melyek krónikus betegségekhez vezethetnek

3. A rák különböző aspektusai

• terápiás válasz

• prognózis

• kiújulás

4. Alapvető kérdések a gének szabályozásával kapcsolatban.

(24)

24

• szervszintű (pl. agyban vagy vesében)

• az egyedfejlődés során (pl. magzati vagy felnőtt szövetek)

• a környezeti hatásokra adott dinamikus válasz (pl. korai válaszadó gének)

• betegség hatására

• génaktivitás

Génexpresszió és betegségek: jó korreláció az RNS expressziós szintek és a fenotípus között.

A génexpresszió szabályozásának alapesetei

(25)

cDNS

DNS RNS protein

cDNS

UniGene SAGE Microarray

A génexpresszió globális analízise

(26)

26

A génexpresszió az a folyamat, melynek során a génben levő információ struktúrákká (protein) és sejtbeli funkciókká fordítódik le.

A microarray alapkoncepciója, hogy egyedileg mérje a mRNS-ek mennyiségét, és ezáltal azonosítsa, mely géneket expresszálja (használja) a sejt.

Microarray

cDNS

(27)

Pillanatfelvétel, mely egyszerre többezer gén aktivitását rögzíti.

Szabályos mátrixba rendezett, próbákat tartalmazó mikropöttyök összessége, ahol minden pötty egyféle szekvenciájú nukleinsavat (próbát) tartalmaz,

ami egy génnek felel meg.

Génexpressziós microarray-k

A rendszer alkotóelemei:

• szilárd hordozófelület

• DNS próbák: cDNS vagy oligonukleotida, ismert gének homológjai

• Vizsgálandó minták (mRNS-ből jelölt cDNS)

• Szkenner (szignál rögzítés)

• Számítógépes algoritmus (adatelemzés)

(28)

28

Affymetrix expressziós array-k

(29)

(30)

30 Kontroll

Teszt

Fluoreszcensen jelölt próbák készítése

Hibridizálás mosás szkennelés

Fluoreszcencia mérése, két csatornán

piros zöld

Adatanalízis génexpressziós mintázat azonosítása

Nyomtatott expressziós array-k

(31)

Kontroll

Teszt

Biotinnal jelölt próbák készítése

Hibridizálás festés

mosás Szkennelés

Analízis

Affymetrix expressziós array-k

(32)

32

A microarray minőségi konzorcium (MAQC)

A MAQC Konzorcium cikksorozatot publikált a Nature Biotechnology- ban : 2006 szeptember, 24(9).

20 mikroarray terméket és háromféle technológiát értékeltek, 12000 RNS transzkript expresszióját vizsgálva humán tumorsejtvonalakban vagy

agyszövetben. A kísérleteket végző laboratóriumok és a különböző

platformok eredményeiben (szabályozott gének) nagyban megegyeztek.

(33)

MAQC Konzorcium (2006) Nature Biotechnology 24:1151-1161

(34)

34

MAQC Konzorcium (2006) Nature Biotechnology 24:1151-1161