az Európai Unió új társadalmi kihívásainak
a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen
Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 2.
az Európai Unió új társadalmi kihívásainak
a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen
Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Scholtz Beáta
Molekuláris Terápiák – 2. előadás
1.1 DEFINÍCIÓK
1.2 A BETEGSÉGEKRŐL
1.3 A BETEGSÉGMECHANIZMUSOK FELTÁRÁSÁNAK MÓDSZEREI 1.3.1 A génexpresszió szabályozásának alapesetei
1.3.2 Microarray-k: Funkcionális genomika a rákterápia fejlesztéséért 1.3.3 Genetikai aberrációk és betegségek
1.3.4 Genom microarray-k
1.3.4.1. Array összehasonlító genom hibridizáció (aCGH)
A fejezet célja, hogy ismertesse a funkcionális genomika célkitűzéseit és legfontosabb módszereit. Konkrét példákon kereszül bemutatjuk, hogyan járulhat hozzá ez a tudományág az orvostudomány
fejlődéséhez.
FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 2.
4
Microarray-k:
Funkcionális genomika a rákterápia fejlesztéséért
• Ki tartozik a magasabb kockázatú csoportba (Prognózis)
• Kinél várható jó (vagy gyenge) terápiás válasz
• Alternatívák a kemorezisztens rákok kezelésére
• Létező és új gyógyszerek hatékonyabb alkalmazása
• Gyógyszerek egyedi kombinációinak kidolgozása
5
Herceptin: a páciensek kiválasztásának fontossága
Összes emlőtumoros páciens
Her2+ emlőtumoros páciensek
Herceptin
10% válasz
Herceptin
35-50% válasz
Holly Dressman, IGSP, Genomes 101 2007
Alkalmazható-e ugyanez az általános kemoterápiás kezeléseknél is?
6
Előrehaladott stádiumú petefészekrák Jelenlegi protokoll
Holly Dressman, IGSP, Genomes 101 2007
Műtét
70% teljes válasz 30% részleges válasz Primer kemoterápia
Platina/taxán
Kiújuló betegség
Másodlagos kemoterápia 10-20% válasz
80-90% nincs válasz
Inaktív ágensek - szükségtelen toxicitás Sok pácienst kezelnek eredmény nélkül
7
14 sejtvonal több mint
50 gén
NCI-60 sejtvonal panel
rezisztens és érzékeny sejtvonalak azonosítása
expressziós prediktor a válasz előrejelzésére - Kemoterápiás válasz adatai - Affymetrix expressziós adatok
Kemoterápiás válasz prediktív profil
rezisztens érzékeny
Kemorezisztens tumorok kezelésének újabb lehetőségei
Holly Dressman, IGSP, Genomes 101 2007
8 Potti et al. Nat Med 2006
9
Expressziós mintázat egyéb kemoterápiás ágensekre -
ugyanaz az alapelv
Potti et al. Nat Med 2006
Génlista NCI-60 sejtekre
10
Páciensadatok (petefészekrák)
Már meglévő génexpressziós adatok a GEO adatbázisból Valószínűségi szám, Potti et al. által hozzárendelve
Kemoterápiás válasz adata ua. kísérletből
Potti et al. Nat Med 2006
11
Korreláció onkogén szignál útvonalak aktivációja és
kemorezisztenciák között:
Kombinációs terápia az útvonalakat
célzó gyógyszerekkel?
src: SU6656
PI3K: LY-294002
Potti et al. Nat Med 2006
12
• A sejtbéli információ alapvető tárhelye
• Ugyanazok a DNS aberrációk ismétlődnek a tumorokban - nem hagyható figyelmen kívül!
• Bizonyos fajta DNS aberrációkra nagyon hatékony, általános vizsgálómódszerek léteznek
• A DNS meglehetősen stabil, és sokféleképpen kezelt mintákban is analizálható, pl. kórházi laborokból
származó archív szövetmintákban.
Miért tanulmányozzuk a tumorok DNS-ét?
13
Pontmutáció - egy vagy néhány bázis megváltozása - megváltozik a protein vagy az expressziós szintje
Gén egyik kópiája elvész - expressziós szint csökkenése (tumorszuppresszor elvesztése)
Extra génkópia - expressziós szint nő (onkogén aktiváció)
Génpromoter metilációja/demetilációja - expressziós szint csökken/nő
(tumorszuppresszor elvesztése/ onkogén aktiváció) A DNS törése és a végek aberráns újracsatlakozása új géneket eredményezhet.
Sokféle genetikai aberráció okozhat
fejlődési rendellenességet vagy betegséget
14
Genetikai aberrációk térképezése
Aberráció térképezése
Pozíció finomítása Gén azonosítása
Prognózis, diagnózis, progresszió, stádiumok, terápia választás
genetikai háttere
Valószínűsíthető gén/útvonal teljes biológiai analízise
Génspecifikus terápia
15
Genom microarray-k
Definíció: Olyan microarray technológia, mely a kromoszóma aberrációkat detektálja
Felhasználás: Klinikai laboratórium: fluroeszcens in situ hibridizációval (FISH) komplementer technológia
Kutatólaboratórium: azonosíthatja a betegségek genetikai hátterét Jelentőség: Sok betegséget mikrodeléciók és olyan egyéb kromoszóma
aberrációk okozhatnak, melyeket a FISH technika nem detektál.
SNP array-k még jobb felbontást biztosítanak, és a genotípusról és kópiaszámról is adnak információt.
16
Sokféle microarray, különböző célkitűzésekhez
17
Array összehasonlító genom hibridizáció (comparative genomic hybridization, CGH)
Microarray alapú összehasonlító genom hibridizáció Nem az RNS, hanem a DNS mennyiségét méri
Két mintát hasonlít össze:
Teszt minta
Referencia minta Nagy felbontás
1-3 Mb (teljes genom array CGH), vagy 10-25 kb (oligó aCGH) vs 5-10 Mb (kariotipizálás)
Időigény : 3-4 nap (array CGH) vs 2-4 hét (kariotipizálás) Egyszerű DNS preparálás az aCGH-hoz, szemben a
metafázisos kromoszómák analízisével
18
Array CGH
Tumorokban előforduló genetikai átrendeződések detektálása (tumor genom és normál genom összehasonlítása)
Genom kópiaszám variációk analízise
szegregálódó variánsok léteznek a populációban
Bizonyos patogén variánsok betegségekkel asszociálódnak
Beteg és egészséges egyének genomjának összehasonlítása Genetikai markerekkel kapcsolt, ismert próbák használata a betegségek
jobb megértésehez vezethet
19
Array CGH: azonosítja a DNS kópiaszám változásokat, és pozíciójukat a genomban
pozíció a szekvenciában
Arány
Teszt genom DNS Referencia genom DNS
Extra DNS kópiák a tumorban
DNS vesztés a tumorban
20
Egy tumorgenom array CGH analízise
Extra Vesztett
21
• Olyan génexpressziós változások szelekciója, melyek a tumor
kialakulásának kedveznek. Bizonyos genetikai aberrációk együttesének megtartása szelektív előnyt jelent.
• A genetikaiminstabilitás többféle mechanizmus révén indukál
változásokat a genomban. (Iniciáló onkogén események egérmodellekben és metotrexát rezisztencia MMR deficiens és proficiens sejtvonalakban)
A tumorok kópiaszám profilja két folyamatot tükröz
22
• Az eredmények alapján jobb tesztek alakíthatók ki, melyek az onkogének és tumor szuppresszor gének kópiaszámát detektálják
• Tumorprogresszió monitorozása, korai és metasztatikus léziók
megkülönböztetése FISH próbákkal, melyek a több tumortípusban megfigyelhető kópiaszámváltozások régióit detektálják.
•További kópiaszám markerek azonosítása, melyek tumor predikcióra alkalmasak
• A tumorok kialakulásában közreműködő gének azonosítása és analízise
segíthet olyan új gyógyszerek tervezésében, melyek a diszfunkcionális géneket/útvonalakat veszik célba, és/vagy nem okoznak terápia
rezisztenciát.
aCGH hasznosítása a rákkutatásban
23 Elváltozások egy tumorsejtvonal genomban:
Kromoszomális és microarray alapú CGH megfeleltetése
Amplifikációk: aktivált onkogének
Deléciók: Inaktivált gének (tumorszuppresszorok)
24
„loss-of-heterozygosity” detektálása, kópiaszám változás hiányában is
Tan DSP et al. Laboratory Investigation 2007. 87:737
25
SNP adatbázisok
dbSNP az NCBI honlapon
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP
Humán SNP adatbázis (Whitehead Institute)
http://www.broad.mit.edu/tools/data/genvar.html A SNP Konzorcium (TSC)
http://snp.cshl.org
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
26
27
Új terápiás célpontok azonosítása:
a „felülről lefelé”
módszer
Tan DSP et al. Pathobiology 2008. 75:63
28
Tan DSP et al. Pathobiology 2008. 75:63
Új terápiás célpontok azonosítása:
a „lentről felfelé”
módszer
29
Myeloma multiplex aCGH analízise
Carrasco DR et al. Cancer Cell 2006. 9:313
55 MM sejtvonal, 73 páciens minta
30
nem-hiperdiploid: k3,k4 hiperdiploid: k1, k2
Carrasco DR et al. Cancer Cell 2006. 9:313
Konklúzió:
ch11 extra : jobb prognózis ch1q extra: rosszabb
ch13 vesztés: rosszabb
Myeloma multiplex aCGH analízise:
prognosztikus besorolás
31 Myeloma multiplex kombinált génexpressziós
és aCGH analízise
Carrasco DR et al. Cancer Cell 2006. 9:313
32
Laphámsejtes tüdőrák aCGH analízise
Boelens MC et al. Lung Cancer 2009. 66:372
PIK3CA
3q26.2-q27.3
A: Összes minta
B: Magas kópiaszám változások
33 Laphámsejtes tüdőrák aCGH analízise:
PIK3CA expressziós szintek és amplifikáció korrelációja
Boelens MC et al. Lung Cancer 2009. 66:372
Új terápiás célpont?
34 A PIK3/Akt/mTOR szignál transzdukciós útvonal
35 Klinikai kipróbáláson levő PI3K inhibitorok jellemzői
Ihle N T , Powis G Mol Cancer Ther 2009;8:1-9
