STRUKTURÁLIS MODELLEKBIOREAKT-MSc2009

STRUKTURÁLIS MODELLEK

BIOREAKT-MSc 2009

FERMENTÁCIÓS RENDSZEREK MATEMATIKAI MODELLEZÉSE FERMENTÁCIÓS RENDSZEREK MATEMATIKAI MODELLEZÉSE

STRUKTURÁLIS

STRUKTURÁLIS STRUKTURA STRUKTURA NÉLKÜLI

NÉLKÜLI







 S új x P

x

Homogén, szerkezet nélküli biomassza Homogén, szerkezet nélküli biomassza

Kémiai/enzimes reakciók eredője Kémiai/enzimes reakciók eredője

BLACK BOX MODELL BLACK BOX MODELL

 

 ^x

^  ^e

^{ új x}

^{ P}

Abiotikus fázis komponensei és a Abiotikus fázis komponensei és a biotikus fázis komponensei között biotikus fázis komponensei között

Kémiai/enzimes reakciók Kémiai/enzimes reakciók

BLACK BOX MODELL

BLACK BOX MODELL de szürkülde szürkül

STRUKTURÁLIS MODELLEK

Általános strukturális modell

x x _j

j

 B

  1

 

x ^{ x x} ₁ ^, ₂ ^{,.... x} _j ^{,.... x} _B

BIOTIKUS FÁZIS ÁLLAPOTVEKTORA

B a biotikus fázis komponenseinek száma

sejttömeg célszerűen

X

sejt organellumok

„genetikai anyag”

„szintetizáló anyag”....

biomassza szerkezete KOMPARTMENTEK

KOMPARTMENT-MODELLEK

STRUKTURÁLIS MODELLEK

 ^e

^{, e}

^,....e

  ^S

^{, S}

^,....S

^P

^{, P}

^....P



e   

ABIOTIKUS FÁZIS ÁLLAPOTVEKTORA

A az abiotikus fázis komponenseinek száma N összes szubsztrát

M összes termék N+M=A

R db különbözõ („biokémiai”) reakció játszódik le az abiotikus fázis és a biotikus fázis komponensei között.

 ^r ₁ ^{, r} ₂ ^{, r} ₃ ^{, ...r} _k ^{, ...r} _R 

r  

Elemi reakciósebességek, egységnyi

komponenesek között

STRUKTURÁLIS MODELLEK

B r _{kj k}

k R

  1

A r _{ki k}

k R

  1

k-adik reakcióban az abiotikus fázis i-edik (e

) komponensének A

mennyisége vesz részt,

A

e komponens k-adik reakcióban érvényes

"sztöhiometriai koefficiense."

Az összes reakcióban:

Biotikus fázis x

komponensének sztöhiometriai együtthatója a k-adik reakcióban B

,

x

e reakcióban B

r

sebességgel „képzõdik”.

Az összes reakcióban x

"képzõdési sebessége"

Átalakulási sebessége ekkor: A

r

STRUKTURÁLIS MODELLEK

 ^  ^



i

e e

V f dt

de

Rendszer differenciálegyenletei egy tökéletesen kevert folytonos üzemű reaktorra:

A r

k R



abiotikus fázis

biotikus fázis

^  ^x

^{ x}

 ^

V f dt

dx B r

k R



Hány ilyen egyenlet van? Ahány komponense van az abiotikus(A) Illetve a biotikus fázisnak (B)

B dt r.

x d   A

dt r.

e

d  

STRUKTURÁLIS MODELLEK

A dt r.

e d  

B dt r.

x d  

Sztöhiometriai

mátrixok A B

Konstitutív egyenletek: ^{r  }  ^r ₁ ^{, r} ₂ ^{, r} ₃ ^{, ...r} _k ^{, ...r} _R 

 

r r x e  ,

Sejttömeg modellek (sejtszám-modell elemekkel)

STRUKTURÁLIS MODELLEK

WILLIAMS MODELL

(B=2) x

: a sejttömeg “szintetikus része”,

S növekedést limitáló tápanyag (A=1) x

S tápanyaggal táplálkozik

x

: a sejttömeg “strukturál-genetikus” része, x

asszimilált anyagaival “táplálkozik”, a sejtek önreprodukciójáért felelős

Egy sejt x

mennyisége   sejttömeg sejtszáma N=x

/.

x= x

+ x

  ^S

e  

 ^x

^{, x}



x  

STRUKTURÁLIS MODELLEK

( R=2, )

 

r  r r₁, ₂

 ^r

^{, r}



r  

Szubsztrát felvétel: ^r

^{ k}

^S  ^x

^{ x}

 ^{ k}

^Sx

x

és x

közötti reakció r ₂  k x x _{2 1 2}

1 1

1

k Sx r 

vagy

STRUKTURÁLIS MODELLEK

Sztöhiometriai mátrixok

B

B

B

= B B A

A A

22 21

12 11

21

11





 



 



 



 

A

=-1, mivel az 1. reakcióban S fogy és egységnyi tömeg átalakulásokat figyelünk,

A

= 0, mivel S a 2. reakcióban nem vesz részt,

B

= 1, mivel az x

szintetikus rész az elsõ reakcióban gyarapodik,

B

= 0, mivel x

az elsõ reakcióban részt vesz ugyan, de mennyisége nem változik,

B

= -1, mivel x

jelenti a “tápanyagot” x

számára és B

= 1 mivel a 2. reakcióban x

gyarapodik.

A = ^-1

[ ] 0 ^{B =} [ ^{1 -1 0 1} ]

STRUKTURÁLIS MODELLEK

 

 

dx

dt k S x x k x x B r j

dx

dt k x x B r j

dS

dt k S x x A r i

kj k

kj k

ki k

1 1 1 2 2 1 2

2 2 1 2

1 1 2

1

2

2

    

  

 

  

  

 

    

  

 







=

=

=

1 2

1 2

1 2

;

;

;

A modell differenciálegyenletei

Sx dt k

dx

N x x k

x k dt

dx dt

dN

1

1 2 2

1 2

1







  

STRUKTURÁLIS MODELLEK BIM2 2002

Oldjuk meg! Mik a kezdeti értékek?

Oltóanyag legyen egy előző ferm vége

 

k x x

S x x k x N

2 1 2

1 2

2 1

0

0 0



 

 - k ₁

LEÁLLT:

S = 0, de x

0 és N0 sem míg x

=0

S=S

, x

=x

, N=N

és x

=0.

kezdeti értékek

S

X/NX/N

idő

X₁

Numerikus megoldás

S

S=0 idő

N X

X₁

X/N

in numero "kísérleti" technika :SZIMULÁCIÓ

S-elvonás

STRUKTURÁLIS MODELLEK

A szakaszos ferm bármely időpillanatában:

x S

x

S



  _Y

x/S

= 1!!!









1

1

Sx k S x x x k S x x k x

dt k

dx       

L O G I S Z T I K U S DIFEGYENLET

 

 



 





 

 





 



 

max 1 0

0

max

0 0

1 0

0

0 0

x t exp k

x 1 S

x x

S

t exp k

x 1 S

x x S

L O G I S Z T I K U S EGYENLET

 ^{x x} 

x x μ 1 dt

r dx

max

x

  

Komplikáltabb struktúrális modellek 3

A metabolizmus és a növekedés strukturális modelljei

(H.W.Blanch,D.S.Clark: Biochemical Engineering, Marcel Dekker, NY 1996 Imanaka, T….:J.Ferment.Technol. 51(6) 423 (1973))

1. Monascus α–galaktozidáz termelése

Háttér: Az

α–

1.Monascus gombát glükóz egydüli C/en forráson növesztve nincs α–galaktozidáz termelés.,

2.Glükóz + galaktóz tápoldatban először a glükózt hasznosítja, elfogyása után tér át a galaktóznak a felvételére és felhasználására (diauxia).

3.Ha a glükóz koncentráció egy küszöbérték alá csökken

az α–galaktozidáz indukálódik és termelése

~

4. Ha egy α–galaktozidáz termelő tenyészethez glükózt adnak (küszöb főlé)

~40 perccel később represszió→enzim termelés leáll.

Imanaka (1973) strukturális modell:

szubsztrát transzportot , enzimtermelés génszintű kontroll

Alfa-galaktozidáz (3.2.1.22)

galaktomannánokról

O-glikozil kötés bontása

Rafinóz szaharóz+

D-gal galaktozil-glicerin

glicerin

3 2

*5 mg/l glükóz jelenléte esetén a galaktóz felvétel elhanyagolható,

*A gal felvétel konstitutív és nincsen időkésés a felvételben.

A kísérlet során glükózon növesztett sejteket lecentrifugáltak és kimosták majd 5 mg/l galaktóz tartalmú tápoldatban inkubálták:

a felső görbe szerint a galaktóz felvétel azonnal elindul.

Az alsó görbe azt mutatja,

hogy ugyanezekhez a sejtekhez plusz 5 mg/l glükózt is adtak:

a galaktóz felvétel nem indul el: represszió

STRUKTURÁLIS MODELLEK

G D

D G G

mG mD

SD SG

SD

i

μ S μ S

μ K S K S K S

K

 

  

S_D extracelluláris glükóz koncentráció: DEXTRÓZ S_G galaktóz extracelluláris koncentráció

S_Gi sejten belüli galaktóz koncentráció

Galaktóz-inhibeált glükóz hasznosítás

galaktóz hasznosítás

Ha S_D≥S_Dc, galaktóz transzport a sejtbe azonnal megszűnik, a transzport modellben U=0

és μ_mG = 0 !

STRUKTURÁLIS MODELLEK A galaktóz transzportot hordozós transzporttal modellezzük.

A transzport-fehérje

galaktóz-

(µg gal/mg s.sza)

Ehhez a transzport fehérjéhez kötődik az extracelluláris galaktóz és a hajtóerő „max” tagja (membránban lévő gal cc.) egy

Langmuir féle adszorpciós izoterma szerint függ a külső S_G cc-tól.

A transzport egyenlet:

G G G

Gi m

gal.tr.sebesség U G S S

K S

 

      

belső gal cc.

külső gal cc.

Transzport anyagátadási tényező (h

)

(µg gal/mg s.sza)

   

i e

S

i e

max i

e i e

S

T 3

S S

K

S J S

S S S

S K

E J k





 

 

 

STRUKTURÁLIS MODELLEK

 

G Gi

Gi 1 Gi

m

d S X G S

U S X k S X

dt K S

 

       

Bemegy=transzport a sejtbe

Felhasználódik

(Elsőrendű kinetika: feltételezés)

***

Az

α–

gal távollétében egy R represszor kapcsolódik a génhez és inhibeálja a mRNS szintézist.

DNS

R

GALAKTÓZ

S

RS

mRNS : (M)

α -

galaktozidáz

Transzkripció a

represszor hiányában

Amikor gal jelen van a sejtben, az kapcsolódik a represszorhoz (RS_Gi) és így R nem képes az operonhoz kötődni az enzimszintézis elkezdődhet.

A (nem azonosított) intracelluláris represszort a gomba állandó k₂ sebességgel termeli (a modell feltételezése szerint), ugyanakkor egy elsőrendű reakció szerint bomlik is : k₃R sebességgel,

illetve reverzibilisen kapcsolódik illetve szétválik a galaktózzal/tól.

A rá vonatkozó mérleg egyenlet tehát a következő:

 





dRX k k R k RS k RS X

dt    

A represszornak a DNS transzkripcióra= mRNS termelésre gyakorolt hatása:

A mRNS szintézise a szabad represszor koncentrációjától függ. Amikor gal van jelen, a represszor hozzákötődik, így a szabad represszor koncentráció csökken és így nem tudja megakadályozni a mRNS szintézist.

A mRNS szintézis sebességét arányosnak tételezzük fel a represszor koncentrációnak egy maximális értéktől (R_max) való eltérésével.

A mRNS bomlik is k₇ sebességi állandóval jellemezhető elsőrendű reakcióban.

Így az anyagmérleg a mRNS-re:

 





dMX k R R k M X

dt   

Ha 0 → maximális Ha maximális

→

Mitől változik a Mitől változik a represszor cc-ja?

represszor cc-ja?

Az enzimtermelés sebbessége a mRNS aktuális szintjével arányos:

MX dt k

dEX

 8





Gi Gi

d S X dS dX dS

X S XμXS

dt  dt  dt  dt 

A rendszer mérlegegyenletei:

A belső galaktózra vonatkozó teljes derivált:

G D

D G G

mG mD

SD SG

SD

i

μ S μ S

dX μX X

dt K S K S K S

K

 

 

 

       

 

 

D D

D D G

mD SD SD

i

dSμ S X

dt Y K S K S

K

 

 

G mG G

G SG G

dSμ S X

dt   Y K S



D DC mG

ha S  S akkor μ  0 glükóz represszió

***

Sejttömeg növekedése

Szubsztrátok fogyása

G G

1 Gi Gi G

k S S

Gi

Gi m

dS G S

U S

dt K S

 

          ha S

 S akkor U 0



glükóz gátolja a gal. felvételt.

Fura, de jó!!!

***-ból

 





dR k k R k RS k RSμR

dt     

 





dM k R R k MμM ahol ha R R akkor R R

dt      

μE M

dt k dE

8 









 



d RS k RS k RSμ RS

dt   





Gi Gi

d S X dS dX dS

X S XμXS

dt  dt  dt  dt 

  _{G G}

G Gi

Gi 1 Gi

m

d S X G S

U S X k S X

dt K S

 

     

Teljes derivált!!!

Imanaka a kinetikai paramétereket szakaszos és steady state folytonos tenyészeteket felhasználva határozta meg, az intracelluláris paramétereket becsléssel, a hozamokat kísérletileg állapította meg.

Inokulum: glükózon nőtt sejtek.

Tápoldat:10 g/l glükóz, 3 g/l galaktóz, 5 g/l NH₄NO₃ és KH₂PO₄, 1g/l MgSO₄7H₂O, 0,1g/l YE Kezdeti feltételek: X=0,5 g/l, S_A=10 g/l S_G=3 g/l, S_Gi= 0 μg/gsejt, R=0.91 μg/gsejt,

M=0 μg/gsejt, E=0 Unit/mg sejt, [RS_Gi]= 0 μg/g sejt

A modell jól írja le: *a gal felvételnek gl által történő katabolit represszióját *az ɑ–galaktozidáz előbb lassú, majd gyors növekedését miután a glükóz elfogyott és a gal transzport elindult.

A modell lényege a JM operon modellnek a termékképzési kinetika leírására történő egyszerű felhasználása.

Szaporodás,növekedés

Öregedés

Éretlen sejt

Érett sejt

Éretlen sejtek P

Öregedés,termékképzés

Struktúrális modellek 4

Koreloszlás (öregedés) modell antibiotikum termelésre

(H.W.Blanch,D.S.Clark: Biochemical Engineering, Marcel Dekker, NY 1996 241-244

Profázis -idiofázis

X1

X2

rmelik érettek te

az terméket a

dt 2

dX k

1 dt

dP

fogyaszt populáció

X 2 az ot szubsztrát

K S

S S X 2 max

Y - 1 dt

dS

K S

S S X 2 max

X 1 a 12

dt 2 dX

K S

S S X 2 2 max

1 12 X

dt 1 a dX

érettekké a

átalakulás

osztódása érettek

éretlenek









 







 











 









 











X₁ - éretlen sejtek koncentrációja X₂ - érett sejtek koncentrációja P - termékkoncentráció

X₁+ X₂ – sejtpopuláció mérete Y - sejthozam

a₁₂ - érési sebességi konstans (ez egy μ tulajdonképpen, akárcsak

μ

μ

illetve a K

(Monod-kinetika)

Bacillus brevis gramicidin-S (ciklikus dekapeptid) termelés szimulálása A Gramicidin-S szintetáz aktivitás a növekedés kései

exponenciális szakaszában drámaian megnő és ennek következtében ekkor kezdődik el a Gramicidin-S szintézis és a stacionárius fázisban

folytatódik

A konstansok becslése szakaszos fermentációból származó adatok alapján a t_m - érési idő bevezetésével történt.

Az a sebesség, amellyel a sejtek öregednek (érnek) illetve átlépnek az idiofázisba, egy t_m idővel korábbi éretlen sejt növekedési sebességtől függ, azaz

t m dt t

t dX dt 2

dX  

A termékképződési sebesség e definíció alapján, valamint annak integrálja a következő:

 









P

tm dt t

dX k

t 1 dt dP













 







 





A metabolizmus és a növekedés strukturális modelljei

(H.W.Blanch,D.S.Clark: Biochemical Engineering, Marcel Dekker, NY 1996 231-236)

A Saccharomyces cerevisiae sejt energia és anyagcsere modellje

BIOREAKT 2009-MSc

G1 mitózis utáni gap:

S fázis: DNS replikáció G2 fázis: gap

M fázis: mitózis, sejtosztódás

Szubsztráttól függ Változó hosszúságú

Szubsztráttól független Állandó hosszúságú

A modell a sejtciklusnak két fő állomásra bontásán alapszik. G1 hossza a limitáló szubsztrát hozzáférhetőségétől függ míg a S, G2, M fázisok összegét a szubsztrát koncentrációjától függetlennek tételezzük fel.

C A B r

CO 2 B 2B

E r a 3 2 A

O

CO 2 2 E

a A 2B

S r a 1 A



 





 





 















A sejttömeg két részből áll = a modell kétkompartmentes(a biotikus fázis két komponensű)

A tömeg, amely a szubsztrát felvételét és az energia termelést végzi és B sejttömeg, amely reprodukcióért és osztódásért felelős.

Ebben ez a modell megegyezik a Williams modellel.

A B tömeg állandó sebességgel konvertálódik A-vá és

A pedig felveszi a S-ot és termeli a B-t mégpedig időben változó sebességgel.

BIOREAKT 2009-MSc

A + B = X , ami a teljes sejttömeg E az etanol koncentrációja.

S S K A S k1 rA

 

E E K A E k 2 r B

 

C kB

r 

a fermentáció sebessége

respiráció sebessége

a sarjadzás sebessége

rA a1 dt

dS

rB a3 rA

a2 dt

dE

rC rB

rA dt

dA

rC 2rB

2rA dt

dB























Elemi reakciósebességek:

Konstitutív egyenletek

C A B r

CO2 B 2B

E r a3 2 A

O

CO2 2E

a A 2B

S r a1 A



 





 





 















a séma alapján:

1,2,3,!!!!

Kettő keletkezik, egy fogy

rA a1 dt

dS

rB a3 rA

a2 dt

dE

rC rB

rA dt

dA

rC rB

A 2 r dt 2

dB





















 _S

KS A S k1 rA

 

E E K A E k 2 r B

 

C kB

r 

k₁ = 5,5 h^-1 a₁ = 6,67 k = 0,51 h^-1 a₂ = 2,8 k₂ = 0,3 h^-1 a₃ = 2,22 K_S = 0,5 g/l K_E = 0,02 g/l

 

X 0,048 r óra

mol/g

qO

 

q

(mol/g*óra)= ( 0.4q

-0.52q

-0.48)/12 X r A

a 1 dt

dS X S 1

q    

X a 3 r B r A

a 2 dt

dE X E 1

q 





dt dX X

μ  1

S

=10 g/l E

=0

X

=0.02 pl.!

X=A+B

Modell paramétereinek meghatározása

1.becsléssel, 2.számítással, 3.kísérleti eredményekből

1. Hozamok a fermentációra: 0.15g/g a1

x/S 1

Y  

Respirációra: 0.45g/g

a3 x/S 1

Y  

a₁ = 6,67

a₃ = 2,22

Az etanoltermelés sztöchiometriájából becsülve: a₂ =2,80 2. számítható fajlagos sebességek

X r A a 1 dt

dS X S 1

q    

fajlagos szubsztrát fogyasztási sebesség

fajlagos termékképződési sebesség

X a 3 r B r A

a 2 dt

dE X E 1

q 





fajlagos növekedési sebesség

dt dX X

μ  1

(higgyük el)



a sztöchiometriából: respirációnál az etanol teljes oxidációja CO

-dá

3 mól oxigént igényel minden két mól CO

-ra nézve (e szerint a sztöhiometriai egyenlet szerint: CH

CH

OH + 3O

 2CO

+ 3H

O) Az élesztő elemi összetétele szerint 1,53 g oxigénre van szükség (Y

=1,53) 1 g új sejttömeghez, így =1,53/32=0,048

Fajlagos légzési sebesség

=

 

X 0,048 r X

1.53/32 r óra

mol/g

qO

  



A fajlagos CO

termelési sebesség, q

, a C-mérlegből kapható meg

CO

széntartalma = GLÜKÓZszéntart. - ETANOLszéntart. – SEJTszéntart.

q

(mol/g*óra)= ( 0.4q

-0.52q

-0.48)/12

ɑ₁=72/180 S C-tartalma

ɑ₂=0,48, sejt C-tartalma 24/46

Igen jól leírja a Saccharomyces cerevisiae szén- és energia metabolizmusát:

A B-tömeg lineárisan növekedik míg az A-tömeg a fajlagos növekedési sebességgel csökken.

Kis µ értékeknél a fajlagos S-felvételi sebesség kicsi és az A hányad, ami ezt végrehaja, nagy.

A sejtekbe irányuló S fluxus alacsony és így a sejtek a lassabb de sokkal hatékonyabb respirációs anyagcsereúton termelik energiájukat.

Ellenkező esetben, ha a µ nagyobb, akkor a sejtekbe irányuló ( A-tömegen keresztül történő) szubsztrát fluxus két okból is növekedik:

a sejtenkénti katabolizmus sebesség nő és az A-tömeg csökken.

A megnövekedett fluxus következtében a respirációs út telítetté válik egy a k₂ által meghatározott µ-nél. Ekkor a glikolízis sebessége nő.

Amikor a glikolízises anyagcsereút telítetté válik, a glükózra vonatkozó µ_max – ot érjük el.

Így szakaszos tenyészetben azt látjuk, hogy a kezdeti, glikolízis-támogatta gyors katabolikus fluxus nagy fajlagos növekedési sebességet és kis A-tömeg hányadot eredményez egy csökkent respirációs aktivitással.

Etanol akkumulálódik, és végül ha a glükóz elfogyott, a tenyészet áttér a respirációra és a képződött etanolt asszimilálja.

A respirációkor elegendő alacsonyabb katabolizmus az A-tömeg

növekedését idézi elő és így jelentkezik egy adaptáció és utána egy második

növekedési fázis nagyobb A-tömeggel és a kisebb szükséges katabolikus fluxussal.

k₁ = 5,5 h^-1 a₁ = 6,67 k = 0,51 h^-1 a₂ = 2,8 k₂ = 0,3 h^-1 a₃ = 2,22 K_S = 0,5 g/l K_E = 0,02 g/l 3.kísérleti eredményekből

Modell predikció kísérleti adatokkal

(Von Meyenburg,PhD Dissert, ETH,1969)

Diauxia:a megtermelt etanolon nő

X S

E

Alkoholos erjesztés: Crabtree effektus

Aerob növekedés etanolon

Model predikció folytonos fermentációnál 1

µ=0,25-0,26 h-1

Model predikció folytonos fermentációnál 2