Michaelis-Menten kinetika

Enzimkinetika

Az enzimes reakció sebességének leírása, jellemzőparamé- terek azonosítása. Ha:

E + S ↔ E + P

A sztöchiometriához mindegyiket mól-ban vagy grammban kellene kifejezni. De: az enzimpreparátum sohasem tiszta.

Ezért az enzimek mennyiségét a hatásukalapján adjuk meg:

1

Enzimkinetika

Egy egység (Unit) az az enzim mennyiség, amely 1 µmol szubsztrátot alakít át vagy 1 µmol terméket képez 1 perc alattadott reakció körülmények között.

SI rendszerben: 1 Katal: 1 mol szubsztrátot alakít át 1 s alatt.

Ez hatalmas egység, praktikusabb a nanoKatal = 10^-9Kat 1 U = 16,67 nanoKatal

Fajlagos aktivitás: U/mg, U/ml

2

Michaelis-Menten kinetika

Kiindulási feltételezések:

k_-2= 0 (a második lépés irreverzibilis) az első lépés gyorsan egyensúlyra jut = RAPID EKVILIBRIUM:

Egyensúlyi állandója:

az ES komplex stabil, az EP komplex elhanyagolható

3

k₁SE = k_-1(ES)

(ES) S.E k K k

1 1

s= ⁻ =

E + S ES E + P^k1 k_-1

k2

k_-2

egy aktív centrum, egy szubsztrát aktivitás helyett koncentráció használható (S) >> (E₀) vagyis E₀/ S << 1 a „minket érdeklő” reakciósebesség:

anyagmérleg az enzimre:

V dP dt k (ES)₂

= =

Eo = +E (ES)

Michaelis-Menten kinetika

4

E + S ES E + P^k1 k_-1

k₂ k_-2

Michaelis-Menten kinetika

Osszuk el a két egyenletet:

Helyettesítsük be:

Rendezzük át:

mert volt

5

V E

k (ES) E (ES)

o

= 2

+

V E

k S K E E S

K E

o 2

s

s

= +

1 s

1

k S .E

K k (E S )

= − =

S K

S K 1 S

K S E k

V

s s s o

2 = +

+

=

V_max=k E_{2 o V} ^dP dt k (ES)₂

= =

V V

S K 1 S

K

max

s

s

= + V V S

K S

max s

= +

Michaelis-Menten kinetika

Ebből az sebességi egyenlet:

avagy

6

Leonor Michaelis 1875-1949 Maud Menten

1879-1960

Michaelis, L., Menten, M. (1913) Die kinetik der invertinwirkung, Biochemische Zeitung 49, 333-369

7

M és M

Briggs-Haldane kinetika

Ugyanazok a diffegyenletek, de a feltételezés: (kvázi) állandó-

sult állapot = steady state↓

(S) >>(E₀) vagyis E₀/S << 1 k₁ES > k_-1(ES) ill. k₁ES > k₂(ES)

8

E + S ES E + P^k1 k-1

k2

k-2

( )

( ) ( ) ( )

( )

1 1

1 1 2

2

dS k ES k ES dt

d ES k ES k ES k ES dt

dP k ES dt

−

−

= − +

= − −

=

d(ES)/dt =0

Briggs, G. E., and Haldane, J. B. (1925) A Note on the Kinetics of Enzyme Action, Bio- chem J 19, 338-339.

Briggs-Haldane kinetika

Egy rövid átmeneti szakasz (pre-steady state) után csak nagyon lassú a változás (kvázi-steady state).

9

A Briggs-Haldane kinetika numerikus szimulációja

Pre-

Kvázi- steady state

steady state

( )

( )

( )

d ES k E S k ES k ES 0

dt = ⋅ ⋅ − ⁻ − =

K_m= (k_-1+ k₂) / k₁ E (ES) E+ = _o

( )( ) ( ) ( )

1 1 2

1

1 2

k E S k k ES k E S

ES k k

−

−

⋅ ⋅ = +

= ⋅ ⋅ +

Michaelis állandó

S K V S S K

S E V k

m max m

o 2

= +

= +

11

Briggs-Haldane kinetika

Michaelis-Menten Briggs-Haldane

V V S

K S

max s

= + V V S

K S

max m

= +

1 2

m 1

k k

K k

− +

=

ha (k₁) >> (k₂) akkor a két konstans azonos!

12

Diszkusszió

m s 2

1

K K k

= +k

1 s

1

K k k

= −

S E k S K E

V k _{0 0}

S

2 = ′

≈

katalitikus effektivitás = specfitási állandó

13

S >>K_s

S <<K_s

Diszkusszió

V_max=k₂E₀

derékszögű hiperbola:

V=(Vmax/Ks)S

V V S

K S

max s

= +

↑látszólagos elsőrendű sebességi állandó

Hiperbola

V

S

Vmax

-K_m 0

értelmes tartomány K_m

=

= + −

+ = −

+ +

v_max

A M-M és B-H egyenletekben a V mindig a kezdeti reakcióse- bességet (V₀→ t=0-ra extrapolált sebesség) jelenti.

15

Reakciósebesség

Paraméterbecslés 1

Foster-Niemann módszer

Paraméterbecslés 2

Linearizált ábrázolást használunk, mert:

Hiperbolikus regressziót számolni gép nélkül munkaigényes Az enziminhibíciónál +információt ad.

1. Lineweaver-Burk linearizálás 1/v – 1/S

17

1 1

1

max max

K V = V + V

S

Az L-B linearizálás gyengéje:

18 y = 5,0546x + 6,0482

y = 7,4335x + 6,4231 y = 11,834x + 6,544

0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000 90,000 100,000

-1,000 0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000 8,000

Adatsor1 Adatsor2 Adatsor3 Lineáris (Adatsor1) Lineáris (Adatsor2) Lineáris (Adatsor3)

nem-ekvidisztánsak a pontok

Linearizálások

2. Hanes-Langmuir linearizálás S/v – S

3. Eady-Hofstee linearizálás v/S – v

19

V

V = V max − K m S K 1

S m S

V V V

max max

= + ⋅

Az enzimkoncentráció hatása

Ha v_max= k₂.E₀, akkor: k₂meghatározása:

Így mérünk enzim aktivitást, nagy S koncentrációnál! 20

V_max: nem maximum, hanem limit → határsebesség Nem enzimtulajdonság, mert függ E₀-tól: V_max= k₂. E₀ →

= AKTIVITÁS

Ak₂ enzimtulajdonság = turnover number, váltásszám [s^-1]→ az enzimmolekula átalakítási frekvenciája

Kiterjesztés minden enzimre és minden kinetikára:

k_cat[ s^-1 ]: egy enzimmolekula átalakítási frek- venciája S-telítés esetén: egy enzimmolekula időegység alatt hány molekula szubsztrátot alakít át.

V_max= k_cat. E₀

A kinetikai paraméterek

21

A kinetikai paraméterek: K

, K

az enzim affinitása a szubsztráthoz

az élő sejtben közelítőleg ennyi az S koncentráció, mert így önszabályozó, és van tartalék kapacitás is.

Változott a K_S→ Inhibitor? Aktivátor?

Enzimanalitika:

Ha aktivitást mérek:

S >> K_S v = v_max ha szubsztrátkoncentrá- ciót mérek:

S ≈ K_S lineáris tartomány

S-re nagyon érzékeny 22

S-re érzéketlen

k₁ 10⁷-10¹⁰ dm³mol^-1min^-1[max. érték (10¹¹) a kis molekulák diffúziósebessége]

k_-1 10²-10⁶min^-1 k₂ 50-10⁷min^-1 K_m 10^-6- 10^-2 mol/dm³

23

A kinetikai paraméterek

K_cat:α-amiláz: 500 s^-1, glükoamiláz: 160 s^-1, glükóz-izomeráz: 3 s^-1

M 10

1s 1M

s M 10 s K 10 k

7 1 1 7 1 1 7 m cat

−

−

− −

− = =

=

k

értékek

kcatalsó határa metabolikus en- zimeknél

Legtöbb enzim e két szélső eset között

Természetes enzimeknél: >10⁵ Mesterséges E-nél (DNA-zyme, abzyme:<10³⁾

24

0 cat

max k .E

V =

Ms= 60000 1 U/mg k_cat=1 s^-1

1 3

1s μmol/μg 60000 μg. 1 60s.10

μmol 1 1min.1mg

μmol

1U/mg = 1 = = ⁻

Ha az enzim móltömege 60000 és fajlagos aktivitása 1 U/mg, akkor k_catéppen 1 s^-1

(1 U = 1 μmol/min)

Aktivitás és váltásszám

Alap: minden enzimes reakció reverzibilis – egyensúlyra vezet.

Sokszor ez az egyensúly erősen eltolódik az egyik oldalra – pl.

a biopolimerek hidrolízisénél (amilázok, proteinázok), más- hol viszont közel 50-50%-os (például a glükóz izomeráz reak- ció)

glükóz fruktóz

Mindkét kinetikai leírásban feltételeztük, hogy a k_-2= 0, ezért a reverzibilis reakciót két ellentétes egyirányú folyamat leírásá- ból állítjuk össze.

Reverzibilis reakciók

26

2 1

2 1 2 1 um) eq(uilibri

2 2 2 1

1 1

k k

k K k K K

k K k k K k

−

−

−

−

=

=

=

=

Reverzibilis reakciók

Fizkém reakciókinetika egymást követő (konszekutív) egyen- súlyi reakciók leírására:

27

A + B C D + E k₁

k_-1 k₂ k_-2

A két ellentétes irányú reakció egyensúlyi állandóit fölírva:

A közös elemet kiemelve:

Az eredő egyensúlyi állandót kifejezhetjük:

( )

s +1 -1

K k k

ES

= =S E

⋅

( )

+1 -2

1 2

k k

k k

S ES P

− E +

= =

+1 +2 eq(uilibrium)

1 2

P k k

K = =S k k_{− −}

Reverzibilis reakciók

( )

p -2 2

K k k

ES

+ P E

= =

⋅

28

E + S ES E + P k₁

k_-1 k2

k_-2

ugyanaz!

K k k

k

K k k

k

ms 2 1

1

mp 2 1

2

= +

= +

−

−

−

V k E

V k E

maxs 2 o

maxp 1 o

=

=

1 2

1 2

1 2

k k

K K

k₋ k₋

= =

1/K_S K_P

Reverzibilis reakciók

HALDANE leírásához:

29

E + S ES E + P k1

k_-1 k₂ k_-2

V K

k k E

k k és V K

k k E k k

maxs ms

1 2 o

2 1

maxp mp

2 1 o

2 1

= + =

− +

− −

−

V K V

K

V K

V K

k k

k k K

maxs ms maxp

mp

maxs mp maxp ms

1 2

1 2

= = = eq

− −

Reverzibilis reakciók

Végezzük el a következőosztásokat:

Egyensúlyi állandóra ugyanazt kaptuk - HALDANE összefüggés

30

E

MI TÖRTÉNIK?

S → P vagy P → S

S

P

Itt feltételezzük az EP komplex létezését:

MITŐL FÜGG?

Reverzibilis reakciók

K

, S , P értéke

?

E + S ES EP E + P k1

k-1

k₂ k-2

Reverzibilis reakciók

Az eredő sebesség a két folyamat különbsége:

V_netto= V_előre - V_vissza = k₂ (ES) - k_-2(EP)

Ezt az eddigiekhez hasonlóan az enzim anyagmérlegével osztjuk el:

ebből:

32

Eo = +E (ES) + (EP)

előre 2 vissza 2

o o

...

v k (ES) v k (EP)

E E (ES) (EP) ... E E

(ES) (EP)

= = −

+ + + +

0 2 0 2

E k (ES) E k (EP)

v E (ES) (EP)

− −

∆ = + +

maxs eq

ms mp

V S P V K

K 1 P S

K

∆

 

−

 

 

 

=  

+ +

 

 

 

Reverzibilis M-M egyenlet

Reverzibilis reakciók

Behelyettesítve:

figyelembe véve, hogy:

azaz

33

s P

S P

(ES) = E (EP) = E

K ... K

max S max P

v (ES) v (EP) v E (ES) (EP)

∆ = −

+ +

max S max P

s p

s p

S P

v E v E

K K

v E S E P E

K K

−

∆ = + +

ahol azaz a

szubsztrát koncentráció eltérése az egyensúlyitól.

pedig analóg -vel, azaz P kompetitív inhibitorként viselkedik.

maxs eq

ms mp

V S P V K

K 1 P S

K

∆

 

−

 

 

 

=  

+ +

 

 

 

Reverzibilis reakciók

34 eq

eq

P S

K =

mp

1 P K

 

+

 

 

  I

1 I K

 

+

 

 

(S - S )eq