m m Enzimkinetika Enzimkinetika

Enzimkinetika

Az enzimes reakció sebességének leírása, jellemzőparamé- terek azonosítása. Ha:

E + S ↔ E + P

A sztöchiometriához mindegyiket mól-ban vagy grammban kellene kifejezni. De: az enzimpreparátum sohasem tiszta.

Ezért az enzimek mennyiségét a hatásuk alapján adjuk meg:

1

Enzimkinetika

Egy egység (Unit) az az enzim mennyiség, amely 1

µ

szubsztrátot alakít át vagy 1

µ

SI rendszerben: 1 Katal: 1 mol szubsztrátot alakít át 1 s alatt.

Ez hatalmas egység, praktikusabb a nanoKatal = 10^-9Kat Fajlagos aktivitás: E/mg, E/ml

Michaelis-Menten kinetika

Kiindulási feltételezések:

k_-2= 0 (a második lépés irreverzibilis) az első lépés gyorsan egyensúlyra jut = RAPID EKVILIBRIUM:

Egyensúlyi állandója:

az ES komplex stabil, az EP komplex elhanyagolható

3

k

S.E = k

(ES)

(ES) S.E k

K k

1 s = ⁻1 =

E + S ES E + P

k_-1

k₂ k_-2

V dP

dt k (ES)₂

= =

(ES) E

E

= +

Michaelis-Menten kinetika

egy aktív centrum, egy szubsztrát

aktivitás helyett koncentráció használható (S) >> (E₀) vagyis E₀ / S << 1 a „minket érdeklő” reakciósebesség:

anyagmérleg az enzimre:

E + S ES E + P

k_-1

k₂ k_-2

Michaelis-Menten kinetika

Osszuk el a két egyenletet:

Helyettesítsük be:

Rendezzük át:

mert volt

5

V E

k (ES) E (ES)

o

= 2

+

V E

k S K E

E S

K E

o 2

s

s

= +

(ES) S.E k

K k

1

s = ⁻1 =

S K

S K

1 S K

S E

k V

s s s o

2 = +

= +

V

= k E

dt k (ES)₂

= =

V V

S K 1 S

max

K

s

s

= + V V S

K S

max s

= +

Michaelis-Menten kinetika

Ebből az sebességi egyenlet:

avagy

Leonor Michaelis 1875-1949 Maud Menten

1879-1960

Michaelis, L., Menten, M. (1913) Die kinetik der invertinwirkung, Biochemische Zeitung 49, 333-369

7

M és M

Briggs-Haldane kinetika

Ugyanazok a diffegyenletek, de a feltételezés: (kvázi) állandó- sult állapot =

(S) >> (E₀) vagyis E₀/S << 1 k₁ES > k_-1(ES) ill. k₁ES > k₂(ES) E + S ES E + P^k1

k_-1

k₂ k_-2

( )

( ) ( ) ( )

( )

1 1

1 1 2

2

dS k ES k ES dt

d ES k ES k ES k ES dt

dP k ES dt

−

−

= − +

= − −

=

d(ES)/dt =0

Briggs, G. E., and Haldane, J. B. (1925) A Note on the Kinetics of Enzyme Action, Bio- chem J 19, 338-339.

Briggs-Haldane kinetika

Egy rövid átmeneti szakasz (pre-steady state) után csak nagyon lassú a változás (kvázi steady state).

9

( )

( )

( )

d

2 1

1 − − =

= ₋

K

= (k

+ k

) / k

E (ES) E+ = _o

( )( )

( ) (

)

1 2 1 1

k k

E.S ES k

ES k k E.S k

= +

+

=

−

−

Michaelis állandó

S K

V S S K

S E V k

m max m

o 2

= +

= +

Briggs-Haldane kinetika

Michaelis -Menten Briggs-Haldane

V V S

K S

max s

= +

V V S

K S

max m

= +

1 2

m

1

k k

K k

− +

=

ha (k₁) >> (k₂) akkor a két konstans azonos!

11

Diszkusszió

2

m s

1

K K k

= + k

1 s

1

K k k

= −

S E k S K E

V k _{0 0}

S

2 = ′

≈

katalitikus effektivitás = specfi(ci)tási állandó

S >>K_s

S

K

Diszkusszió

V_max=k₂E₀

derékszögű hiperbola:

V=(V_max/K_s)S

V V S

K S

max s

= +

A M-M és B-H egyenletekben a V mindig a kezdeti reakcióse- bességet (V₀ → t=0-ra extrapolált sebesség) jelenti.

13

Reakciósebesség

Linearizálások

Linearizált ábrázolást használunk, mert:

Hiperbolikus regressziót számolni gép nélkül munkaigényes Az enziminhibíciónál +információt ad.

1. Lineweaver-Burk linearizálás 1/v – 1/S

1 1

1

max max

K

V = V + V

S

Linearizálások

2. Hanes-Langmuir linearizálás S/v – S

3. Eady-Hofstee linearizálás v/S – v

15

V

V = V max − K m S K 1

S m S

V V V

max max

= + ⋅

tg α= k₂

Az enzimkoncentráció hatása

Ha v_max = k₂.E₀, akkor:

V_max: nem maximum, hanem limit → határsebesség Nem enzimtulajdonság, mert függ E₀-tól: V_max= k₂. E₀ →

= AKTIVITÁS

A k₂ enzimtulajdonság = turnover number, váltásszám [s^-1] → az enzimmolekula átalakítási frekvenciája

Kiterjesztés minden enzimre és minden kinetikára:

k_cat[ s^-1 ]: egy enzimmolekula átalakítási frek- venciája S-telítés esetén: egy enzimmolekula időegység alatt hány molekula szubsztrátot alakít át.

V

= k

. E

A kinetikai paraméterek

17

érzéketlen

A kinetikai paraméterek: K

, K

az enzim affinitása a szubsztráthoz

az élő sejtben közelítőleg ennyi az S koncentráció, mert így jól szabályozza a sebességet

Változott a K_S→ Inhibitor? Aktivátor?

Enzimanalitika:

ha aktivitást mérek:

S>>K_S v=v_max

ha szubsztrátkoncentrá- ciót mérek:

S<<K_S lineáris tartomány

k₁ 10⁷-10¹⁰ dm³mol^-1min^-1[max. érték (10¹¹) a kis molekulák diffúziósebessége

k_-1 10²-10⁶ min^-1 k₂ 50-10⁷ min^-1

K_m 10^-6 - 10^-2 mol/dm³

19

A kinetikai paraméterek

M 10

1s 1M

s M 10

s K 10

k

7 1 1

7 1 1 7 m cat

−

−

− −

− = =

=

k

értékek

k

alsó határa metabolikus en- zimeknél

Legtöbb enzim e két szélső eset között

Természetes enzimeknél: >10

Mesterséges E-nél (DNA-zyme,

abzyme:<10

Alap: minden enzimes reakció reverzibilis – egyensúlyra vezet.

Sokszor ez az egyensúly erősen eltolódik az egyik oldalra – pl.

a biopolimerek hidrolízisénél (amilázok, proteinázok), más- hol viszont közel 50-50%-os (például a glükóz izomeráz reak- ció)

glükóz fruktóz

Mindkét kinetikai leírásban feltételeztük, hogy a k_-2= 0, ezért a reverzibilis reakciót két ellentétes egyirányú folyamat leírásá- ból állítjuk össze.

Reverzibilis reakciók

21

A két ellentétes irányú reakció egyensúlyi állandóit fölírva:

A közös elemet kiemelve:

Az eredő egyensúlyi állandót kifejezhetjük:

( )

s +1 -1

K k k

ES

= = S E

⋅

( )

+1 -2

1 2

k k

k k

S ES P

− E +

= =

+1 +2 eq(uilibrium)

1 2

P k k K = = S k k

Reverzibilis reakciók

( )

p -2 2

K k k

ES

+ P E

= =

⋅

E + S ES E + P k₁

k_-1

k₂ k_-2

ugyanaz!

E

MI TÖRTÉNIK?

S → P vagy P → S

S

P

Itt feltételezzük az EP komplex létezését:

MIT Ő L FÜGG? K

, S , P értéke

Reverzibilis reakciók

?

E + S ES EP E + P k₁

k_-1

k₂ k_-2

Reverzibilis reakciók

Az eredő sebesség a két folyamat különbsége:

V_netto= V_előre - V_vissza = k₂ (ES) - k_-2(EP)

Ezt az eddigiekhez hasonlóan az enzim anyagmérlegével osztjuk el:

ebből:

E

E (ES) + (EP)

előre 2 vissza 2

o o

...

v k (ES) v k (EP)

E E (ES) (EP) ... E E

(ES) (EP)

= = −

+ + + +

0 2 0 2

E k (ES) E k (EP)

v E (ES) (EP)

− −

∆ = + +

maxs

eq

ms

mp

V S P V K

K 1 P S

K

∆

 

−

 

 

 

=  

+ +

 

 

 

Reverzibilis M-M egyenlet

Reverzibilis reakciók

Behelyettesítve:

figyelembe véve, hogy:

azaz

25

s P

S P

(ES) = E (EP) = E

K ... K

max S max P

v (ES) v (EP ) v E (ES) (EP )

∆ = −

+ +

max S max P

s p

s p

S P

v E v E

K K

v E S E P E

K K

−

∆ = + +

ahol azaz a

szubsztrát koncentráció eltérése az egyensúlyitól.

pedig analóg -vel, azaz P kompetitív inhibitorként viselkedik.

maxs

eq

ms

mp

V S P V K

K 1 P S

K

∆

 

−

 

 

 

=  

+ +

 

 

 

Reverzibilis reakciók

eq eq

P S K =

mp

1 P K

 

+

 

 

  I

1 I K

 

+

 

 

(S - S )